• Forum - Plasmide, Cellules, Protéine, Question

[Biologie Moléculaire] pcr comment commencer

Je suis cencer realiser une transfection pour obtenir la secretion d'une proteine par des cellules H4. Parallelement on me demande de realiser des primers correspondant a la sequence en acides nucleique de cette proteine donc.  [...] Enuite tu vas transfecter ton plasmide dans des cellules et si tout se passe bien tes cellules devraient produire ta protéine en question.  [...]

[Génétique] Transfection transitoire plasmide/siRNA

Ma question concerne les mécanismes qui se mettent en place après une transfection transitoire d'un plasmide codant pour une protéine ou d'un siRNA. Je m'explique. quand on transfecte un plasmide d'expression codant pour la GFP par ex c'est transitoire cad qu'au bout de 48H la fluorescence commence à disparaître (dilution globale ou par cellule) que se passe-t-il pour la descendance.  [...] - que devient la protéine transfectée ici la GFP, les cellules filles sont-elles deux fois moins vertes ou un est verte et l'autre non, ou les cellules filles contiennent encore du plasmide qui s'exprime.  [...]

[Biologie Cellulaire] Dominant négatif

bonjour tout le monde, est ce que quelqu'un peut m'expliquer comment ça marche concrètement une expérience de dominant négatif j'ai ma lignée cellulaire ou je veux éteindre ma protéine, je les transfecte à l'aide d'un plasmide contenant la séquence mutée et je la trouve ou cette séquence et le plasmide ça s'achète ma question est peut être bête mais je n'ai jamais fais ça alors j'ai besoin d'éclaircicements, merci.  [...] Où trouver un dominant négatif Soit il est déja caractérisé dans la littérature, auquel cas tu peux contacter le labo qui a publié pour avoir le plasmide, ou bien il est commercialisé, sinon, il faut le faire. La ce sera de la mutagénèse dirigée, mais concernant le site à muter, cela dépend de la fonction de ta protéine que tu souhaites éteindre.  [...]

[Biologie Moléculaire] Préparation de plasmide, chloramphenicol

2. Et puis, je ne comprend pas trop pourquoi le chloramphenicol tue les bacteries. D'apres ce que j'ai lu, ca bloque la proliferation des cellules mais ca ne devrait pas les tuer. Une hypothese. en bloquant la synthese proteique, estce que le chloramphenicol ne rend pas les bacteries plus sensibles a l'ampicilline (le plasmide porte le gene de resistance a l'ampicilline, on cultive donc les bacteries en presence d'ampicilline, mais en concentration deja faible (50mg/mL)).  [...] 3. Et puis autre question, j'ai egalement lu que l'origine de replication colE1 pourrait necessiter un cofacteur bacterien tres instable. Cultiver des bacteries avec ce plasmides en presence de chloramphenicol ne devrait donc pas permettre d'augmenter le nombre de copie par cellules, puisque si la synthese de proteine est inhibee, le facteur en question n'est pas renouvele, donc le plasmide n'est pas replique.  [...]

[Biologie Cellulaire] Compter les passages

Bon en fait j'ai une lignée qui exprime une récepteur calcique transfecté avec un plasmide comprenant une résistance (G418) Donc à chaque passage, je dois avoir des cellules exprimant assurément le plasmide (autrement ils n'auraient pas la résistance et mourraient) et donc le récepteur en question.  [...] En résumé, même si tes cellules sont résistantes au G418, il est possible qu'elles n'expriment plus ta protéine suite à une mutation de sa séquence, ou du promoteur. Une autre hypothèse comme je l'ai dit précédement est que certains promoteurs sont sensibles aux métabolites secondaires produits durant la vie de la cellule, et qu'ils s'inhibent au fur et a mesure.  [...]

[Biochimie] Protocole IMAC

J'ai effectué une transfection d'un plasmide PcDNA 3 contenant un insert codant pour une protéine recombinante possédant un Tag His (6 fois)en N-Terminal, dans des cellules adhérentes HEK-293 (eucaryote).  [...] Par la suite je compte réaliser un dessalage pour éliminer l'imidazole du tampon d'élution. Puis, la protéine sera conservée dans du PBS à 4°C.  [...]

Y a-t-il une différence entre un spécimen ogm et un non ogm ?

donc oui ils pourraient car non il n'y a pas que le gène de la protéine en question qi est ajouté, mais tout ce qui se trouve dans la zone du plasmide Ti entre les deux sequences bordantes.  [...] Ca à l'avantage, qu'au lieu d'ajouter d'ajouter l'allèle en 'linserant (et donc avec tout ce qui est nécessaire à l'insertion d'un gène), tu le crée directement, tu peux aussi te servir de ca pour faire apparaitre un codon stop et inhiber la protéine en question si tu veux faire du knock out sans insertion de T-DNA dans le gène (l'insertion de T-DNA est visible, l'insertion d'un codon stop est tout ce qu'il y a de plus naturelle) ou au contraire faire disparaitre un codon stop, modifier un acide aminé pour le rendre phosphorylable (si a cet endroit il s'agit d'une sérine dans une autre accession mais dans la tienne il s'git d'une forme non phosphorylable ou la sérine a été remplacée, induisant un phénotype différent par incapacité d'etre phosphorylée) ou même la rendre toujours active (ou inactive) en remplacnt cet acide aminé par un acide aspartique (charge négative mimant la phosphorylation) dans le but d'augmenter une caractéristique de ton organisme.  [...]

[Biologie Moléculaire] Dominant négatif

Alors en fait si j'ai bien compris c'est au niveau génétique que ça se passe, on va modifier le gène de cette protéine de sorte que toutes les protéines produites seront non fonctionnelles donc on peut apparenter ça a un KO mais comment fait on cette manipulation concrétement j'ai une lignée cellulaire qui surexprime une protéine et je veux l'inhiber pour en étudier les effets quelle est la marche à suivre au point de vue technique.  [...] En fait, tu transfectes tes cellules (qui expriment la protéine sauvage à leur surface) avec un plasmide codant pour cette même protéine mais qui est mutée (souvent il y a une délétion de la partie intracellulaire du récepteur ce qui empêche la transduction de se faire).  [...]

Pureté de l'ADN / efficacité d'expression

Certains d'entre vous ont ils déjà constaté que la pureté de l'ADN au départ pouvait affecter la capacité des cellules, ensuite, à exprimer *correctement* les protéines Je ne parle pas ici de taux de transfection, qui est bon, ce que m'indique la GFP co-transfectée par exemple.  [...] pour ce qui est de la pureté de ton ADN pour les transfections, si tu tourne autour de 1,6-1,7 c'est vraiment bien. Pour être honnête, moi j'avais une prép de plasmide qui tournait plutôt autour des 1,4-1,5 et mes transfections sur cellules marchaient très bien, y compris le taux d'expression de la protéine qui convenait pour mon type de manip.  [...]

[Biologie Moléculaire] différence entre 2 plasmides

Un plasmide d'expression est un plasmide qui une fois entré dans la cellule permet de produire une protéine alors qu'un plasmide reporter est une construction qui va permettre de reporter l'activité de la protéine synthétisée par le plasmide d'expression. Il s'agit le plus souvent d'un promoteur qui répond à la protéine produite qui est donc un facteur de transcription.  [...] Si la protéine se fixe sur le promoteur elle va induire la transcription et la traduction d'une protéine rapporteur le plus souvent la luciférase qui émet de la lumière. L'activité de la protéine testée va donc être rapportée par la quantité de lumière émise.  [...]