• Forum - Plasmide, Cellules, Mammifères

[Biologie Moléculaire] Purification d'un plasmide à partir de cellules mammifères??

Pensez-vous qu'il soit possible d'isoler et purifier un plasmide (EBV = pas d'intégration et expression à long terme sous sélection) à partir de mes lignées cellulaires transfectées.  [...] Merci des conseils je ne sais pas si je vais le faire tout de suite mais si j'essaie je vous tiendrai au courant. En fait mon idée serait de faire une sorte de criblage car en gros je complémente un phénotype de blocage du cycle en transfèctant certains micro-ARNs et je me dis qu'en transfectant un pool de micro-ARNs (exprimés via ce plasmide) je pourrai récupérer les clones qui poussent et alors regarder quel(s) micro-ARN(s) a favorisé la prolif.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide

Dans ta dernière question, je suppose que tu suggère d'intégrer un plasmide dans une cellule eucaryote et de le garder en tant que tel, c'est à dire qu'il ne s'intègre pas au génome. Je pense que c'est possible de façon spontanée chez S. Cerevisiae. Pour des cellules de mammifères, cela nécessite qu'elles soient au préalable transformées avec l'antigène T de SV40, comme c'est le cas pour les cellules Cos-7.  [...] Cet antigène permet au plasmide d'être répliqué par la cellule, et donc d'être conservé pendant une période plus longue. Sauf exception, la présence de cet antigène est absolument nécessaire dans les cellules de mammifères pour qu'il y ait réplication d'un plasmide.  [...]

Transformation/inativation d'un gène

Chez les cellules de mammifères normales il n'y a pas de plasmide et pourtant tu peux très bien faire de l'expression plasmidique.  [...] Ok, don si j'ai bien compris je construis mon plasmide avec les extrémités du mon gène a déléter, plus un gène de sélection, et après il faut transfecter ce plasmide donc le champignon.  [...]

[Génétique] exprimer une protéine dans E.COLI

Mais, tu va devoir modifier ton transcrit d'ADN c de départ pour par exemple utiliser les ARNt que la bactérie utilise le plus souvent, et aussi, tu peux, par PCR, ajouter une séquence à ton plasmide permettant de secréter la protéine dans l'espace périplasmique ou extracellulaire.  [...] il n'y a pas de plasmide replicatif pour les cellules de mammiferes. Au moins tu fais de l'expression transitoire, sinon tu utilises des vecteurs viraux.  [...]

[Journal club] Extinction de l'expression de gènes par les siRNA : la découverte

découverte de l'épissage), a eu la brillante idée d'introduire directement des petits ARN interférents (siRNA) dans les cellules de mammifères en culture pour induire l'extinction (knock-down) de gènes cibles. Cela avait été montré chez d'autres espèces avec des ARN double brin (dsRNA), mais les tentatives étaient vouées à l'échec chez les mammifères.  [...] En conclusion, les auteurs orientent les futures recherches sur les mécanismes d'ARN interférence dans les cellules de mammifères et introduisent aussi la possibilité d'utilisation de cette méthode simple dans les laboratoires et le développement thérapeutique.  [...]

[Biochimie] ARN interférent

Chez les mammifères, en ARN interférence on est obligé d'utiliser des siRNA ou des shRNA qui sont en plutôt des plasmides codant pour des shRNA. On ne peut pas utiliser de dsRNA chez les mammifères sinon cela induit une réponse appelée la réponse interféron qui est un système de défense des cellules de mammifères contre les virus à ARN.  [...] La réponse interféron induit la dégradation de l'ensemble des ARNm de la cellule. Donc la spécificité est nulle. Voilà pourquoi on utilise les siRNA et shRNA sur ces cellules qui eux permettent de cibler spécifiquement la dégradation d'un ARNm particulier.  [...]

[Biotechnologie] Clonage Eucaryote

Concernant le clonage de cellules eucaryotes, est ce possible qu'une cellule de mammifère accepte un plasmide et le réplique comme il faut ou ce plasmide (contenant le gène étranger) doit il absolument être intégré au génome cellulaires.  [...] Oui mais pour utiliser un plasmide dans une cellule de mammifères, faut il alors qu'il y a ait une origine de réplication de type virale ainsi qu'un promoteur type viral.  [...]

influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

2 mg/ml, ça me semble déjà pas mal en cellules de mammifères. Peut-etre que tu as une proteine naturellement difficile à replier (protéine de plus de 40 à 50 kDa, beaucoup de ponts disulfures, peu de structures secondaires,... ) et que quelque soit le peptide signal que tu rajoutes, tu arriveras à une expression assez faible de toute façon.  [...] Mais à 2 mg/ml, tu peux déjà quasiment tout faire ce que tu veux, même si c'est assez fastidieux en cellules de mammifères (2 mg/ml en cellules de mammifères, j'ai déjà donné et c'est vrai que c'est rapidement lourd). A la rigueur, ça peut valoir le coup de tenter en baculovirus, la production sera meilleure, mais il y a un risque d'aggrégation dans le cas d'une glycoprotéine.  [...]

[Biologie moléculaire] Protocole électroporation cellules mammifères

[Biologie moléculaire] Protocole électroporation cellules mammifères.  [...] Je suis à la recherche d'un protocole efficace d'électroporation de cellules de mammifères (plus particulièrement des cellules de type murine C2C12).  [...]

plasmide

En génétique, on utilise les plasmide pour y incorporer des gènes. on créé une séquence d'ADN artificielle (ou on la copie d'un autre gène), et on l'insère dans le plasmide. Comme le plasmide sert en temps normal à exprimer des gènes, celui que l'on a inséré pourra être exprimé par la cellule hôte.  [...] je rajouterais avec vigueur que les plasmides ne sont pas limités aux bactéries... c'est un outil naturellement présent chez la levure, par exemple (simple copie, multi-copie etc) et qu'il peut être intégré dans des cellules de mammifères en culture in vitro.  [...]