• Forum - Plasmide, Bactéries, Compétentes

[Microbiologie] Culture bactérienne troublante

J'ai effectué une transfection d'un plasmide (8.2kb) dans des bactéries super compétentes datant de 2002 (largement expirées) et dans ces même bactéries rendues fraichement de nouveau compétente.  [...] Avec le plasmide controle, la culture présentait un aspect habituel avec une solution LB trouble assez homogène. En revanche la culture avec le plasmide d'intérêt présentait de gros agglutinement de bactéries au fond de la bouteille en plus du LB trouble.  [...]

[Biologie Moléculaire] mutagènese, transformation, transfection

après mutagénése on a digéré le plasmide méthylé par DPN1 pour pouvoir transformer des bactéries compétentes, les bactéries transformé par le plasmides se développe sur milieu contenant de l'antibiotique.  [...] Tu as 2 transformations distinctes en fait. Une première, avec les bactéries, qui te sert à amplifier le plasmide et réaliser la mutagenèse dirigée. Ensuite, tu récupère ton bluescript et tu transfert dans le vecteur POZ. Ensuite, tu transformes des cellules eucaryotes avec le vecteur POZ.  [...]

Problème lors de ligation

Je fais rentrer mon plasmide dans mes bactéries compétentes en faisant un heat chok, puis je dépose sur agar avec l'antibiotique de sélection.  [...] Le deuxième vrai soucis c'est qu'après l'extraction de plasmide (après repiquage des colonies en milieu liquide) je redigère pour vérifier que tout a bien fonctionné et la j'obtiens un smir.  [...]

transformation de bactéries

Je suis actuellement en stage en Angleterre, je travaille sur les telomeres et j'ai un probleme dans une manipulation pourtant basique.   [...] Je dois inserer dans un plasmide de 7.3kb (pGBKT7) une insert de 1926bp, le probleme est qu'apres ma transformation de bacteries (cellules competentes de E.Coli), je n'obtiens absolument aucunes colonies.  [...]

[Biochimie] Mutagénèse dirigée

D'apres ce que tu as décris, il me semble que tu essayes de transformer les bactéries avec seulement le produit de PCR et que tu ne mets pas le plasmide. Ce dernier, qui doit surement contenir un gène de résistance aux antibiotiques, ne peut donc pas empêcher les bactéries de mourir au contact du milieu LB+ampicilline.  [...] A ne pas négliger, le fait que tu es choisi d'autres bactéries que celle du kit. Sont-elles compétentes pour une transformation par choc thermique Est-ce les mêmes que celles utilisées pour les clonages qui ont fonctionné précédemment.  [...]

[Biologie Moléculaire] Tp biomol

Donc en fait dans le 1er on a transforme des bacteries E.Coli en leur inserant un plasmide pBR322. On obtient donc des bacteries competentes resistantes a l'ampiciline.  [...] Ensuite on a integre le melange avec ligase et sans ligase dans les bacteries competentes preparees prealablement. on les met en culture sur X-gal et ampiciline. On observe des colonnies blanches et bleues donc en fait ca c'est pas rapport a l'insert, si il vient s'inserer au niveau du lacZ la B-gal nest pas fonctionnelle et du coup on a des colonnies blanches, au cas contraire elles sont blanches.  [...]

clonages

j'ai quelques questions techniques à propos des clonages. Lorsque l'on utilise 2 enzymes de restriction qui nécessitent la digestion sequentielle du vecteur, j'imagine que vous précipitez le plasmide entre les deux digestions enzymatiques Purifiez vous l'insert avant la ligation avec le plasmide Moi je ne purifie pas parce que je trouve qu'une gel extraction ou une précipitation fait perdre bcp d'insert, surtout que je précipite déja entre les deux digestions enzymatiques.  [...] 50-10 ng c'est bien, mais le point crucial est souvent la qualite des bacteries competentes qui varie beaucoup et peut etre testee avec un plasmide controle. Electrocompetentes,, c'est le mieux. Si tu les faits toi meme, resuspend les tres concentree a la fin.  [...]

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

j'ai d'abord essayé de transformé 1µL du milieu de ligation pour 25µL de bacteries puis 10µL pour 50µL de bacteries mais aucune pousse bacterienne dans les deux cas, le controle positif fonctionne, donc les bacteries que j'ai rendu compétentes sont bien apte a recevoir le plasmide.  [...] @flyingbike. mon expérience perso c'est que la ligation proprement dite est rarement le problème. Quasiment tous les problèmes de ligation que j'ai vu sont en fait des problèmes de restriction ou de transformation (bactéries pas suffisamment compétentes).  [...]

[Microbiologie] transformation

je dois cloner les produits de digestion de la mutagenèse (insert ADN) dans le vecteur PGEX4T1 en transformant les bactéries compétentes DH5± J'ai trouvé des clones sur un milieu 2YT/AMP j'ai fait une miniprep pour extraire le plasmide recombinant simplement sur le gel les produits sont piégés dans le puits j'ai refait la manip à plusieurs reprises je trouve toujours le même résultat avec un smear Aidez moi que devrais je faire.  [...] Ton smear vient des bactéries je pense. Et ce que tu as dans tes puits c'est probablement ton plasmide avec l ADNg de tes bacteries.  [...]

[Microbiologie] Lipopolysaccharide(LPS)

Les bactéries peuvent être placées dans certaines conditions physico-chimiques pour permettre aux plasmides d'être incorporés à l'intérieur de celles-ci. Les bactéries traitées et prêtes à recevoir l'ADN étranger sont appelées bactéries compétentes.  [...] L'episome est une molécule d'ADN qui comme les plasmide peut se répliquer de manière autonome, la différence vient du fait que l'épisome peut s'intégrer dans le chromosome bactérien c'est ça.  [...]