• Forum - Plasmide, Bactérie, Sélection, Colonie, Solution, Insuline

[Biotechnologie] Méthode de purification de l'insuline recombinante

Je vous explique vite fait le contexte, le gène de l'insuline humaine est placé dans un plasmide, ce plasmide dans la bactérie et après sélection de la bonne colonie de bactérie on place la solution bactérienne dans un fermentateur pour obtenir beaucoup d'insuline, etc.  [...] Je sais qu'il y a beaucoup de méthodes de purification mais je ne sais pas laquelle est la plus adapté pour purifier l'insuline une fois que l'on a obtenu l'extrait protéique (insuline + toutes les autres protéines synthétisées par la bactérie).  [...]

[Génétique] Production d'interleukine 2

Il faudrait déjà que tu choisisses ton système de production (eucaryote me parait le mieux..), que tu choisisses ton vecteur (un plasmide me parait pas mal, avec un tag pour la purification), que tu trouves la séquence cDNA de l'IL2 (sequence CDS sur pubmed), que tu définisse ta stratégie de clonage (les bonnes enzymes de restriction en fonction de ton plasmide et de ton insert), tu fais une ligation, puis une transformation en bactérie.  [...] Puis tu fais une culture sur boite de petri avec une sélection par un antibiotique correspondant à ton plasmide. De la tu repiques une colonie et tu fait une culture liquide à partir de cette dernière. A cette étape il est important de valider ta construction par un séquençage et une PCR, après avoir extrait une petite quantité de ton plasmide (ex.5ml de culture extrait par mini prep).  [...]

transformation e.coli par le plasmide pglo

Tu fais ta transfo (tu la fait bien biensur sinon ça risque pas de marcher) puis tu incube overnight. Et le lendemain tu compte le nombre de colonie positives en fonction de ta selection puis tu calcul la quantité de plasmide que tu a utilisé pour la transfo.  [...] Là tu es donc à 0.05µg/µl (puisque j'ai considéré que tes 400µg d'eau stérile c'est enfaite 400µl d'eau stérile LOL) Et donc si ta fait la transfo classique 10µl plasmide + 40µl cellules alors ta étalé 0.5µg de plasmide. Donc si t'a compté 600 colonies admettons, alors l'efficacité c'est.  [...]

mode de resistance aux antibiotiques

Cette pratique est fortement critiquée parce qu'on donne sciemment la résistance à l'antibiotique à une bactérie. Mais d'autres marqueurs de sélection sont en cours de conception (par exemple, mettre dans le plasmide un gène permettant à la bactérie d'utiliser un sucre inédit, comme le xylulose).  [...] Non, c'est là le point important de la résistance bactérienne. l'antibiotique ne modifie pas le taux de mutation de la bactérie. La bactérie mutante est déjà présente (dans toute colonie bactérienne on retrouve des bactéries mutantes), l'antibiotique va juste sélectionner les bactéries résistantes mais en aucun cas il ne modifie le taux de mutation de la bactérie.  [...]

PCR et vecteur de clonage

Une colonie bactérienne sur gélose correspond à peu près à 10 9 bactéries en 24h. Selon les cas tu peux avoir une ou plusieurs copies du plasmide par bactérie.  [...] Pour la PCR vous commencez par une phase à 94° durant disons 10-15 minutes ce qui a pour effet de lyser les bactéries et de libérer le plasmide (j'ai déjà essayé 3 minutes, ça fonctionne mais la lyse n'est pas optimale et on a pas de résultat pour toutes les colonies.).  [...]

[Biologie Moléculaire] Deux bandes en PCR

Tous les groupes ont les deux bandes sauf un Vous travaillez tous avec le même plasmide ou vous avez fait chacun une prep à partir d'une colonie bactérienne.  [...] Sinon le but de l'expérience est purement de l'apprentissege technique pour qu'on soit capable de faire un southern.. A partir d'un plasmide ou d'ADNgénomique on fabrique les sondes..(Dans le reste du TP on transfecte des cellules avec PPAR, RXR un plasmide raporteur qui contient les séquences de liaison au PPAR, ou avec une séquence que l'on veut tester quant à la fixation de PPAR.  [...]

[Microbiologie] Quelques questions en micro

Oui étant donné que ce qui fait la grosseur d'une colonie est le nombre de bactéries. Une colonie plus grosse aura donc eu une activité prolifératrice plus élevée qu'une colonie plus petite (temps de doublement plus faible, résistance à un milieu sélectif, avantage par rapport à une compétition trophique sur la gélose,  [...] Non pour la deuxième question je dirais la localisation de la colonie (si elle est entourée de plusieurs colonies, elle sera plus petite qu'une colonie bien isolée) et éventuellement que le nombre de bactéries ayant participé à former la colonie. En effet si lors de l'ensemencement deux bactéries étaient très proches, elles ont participé à former la même colonie (c'est assez mal dit.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR : migration après amplification (sans digestion enzymatique)

Je dispose de deux colonies bactériennes une blanche et une bleue (ayant donc subi un criblage blanc-bleu) donc une ayant intégré l'insert au niveau du polylinker et l'autre non. Le plasmide originel faisait 3900 pb et l'insert 240. J'en déduis donc qu'une colonie blanche a un ADN de taille 3900+240 soit 4140 pb et une bleue de 3900 pb.  [...] Là je ne suis pas sure de moi du tout. est-ce que pour la colonie bleue il n'y a pas de produit d'amplification et pour la colo blanche il y en a un de 240 pb Je trouve ça illogique car la PCR amplifie l'ADN, or la colonie bleue même sans insert contient bien un plasmide donc de l'ADN.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagenèse: Pb...

Chez d'autres bactéries comme E. coli DH5 alpha, avec 10 ng de plasmide on a un nombre de colonie énorme sur boite. Donc faire preuve de retenue lorsque l'on n'est pas d'accord avec un protocole fonctionnant pour quelqu'un d'autre me parait judicieux.  [...] Après transfo on étale sur LBA pour pouvoir selectionner les colonies qui expriment le plasmide muté. Et non je n'obtiens aucune culture.  [...]

[Microbiologie] L'alcool à 90° est-il plus efficace que la javel contre les bactéries ?

2) Les deux. Il s'agit simplement de pouvoir isoler une colonie, donc en principe un clône bactérien - la colonie résultant théoriquement d'une bactérie, même en cas de contaminant, on arrive à faire une galerie d'identification relative à cette colonie/bactérie.  [...] Quand on fait par exemple un prélèvement de pus depuis une blessure, l'infection peut être due à un ou davantage de pathogènes. On va donc procéder à la technique du cadran afin de séparer les espèces et isoler des colonies ==. on en revient à une bactérie/colonie par galerie d'identification.  [...]