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[Biochimie] glycine

Dans le gel de resolving, la vitesse de migration des ions glycinates augmente dans le gel de séparation, car le pH du gel de séparation est de 8.8, donc les protéines sont moins rapides que les ions porteurs. Les protéines se font dépasser par les ions glycinates et les différents complexes protéines-SDS se séparent grâce aux pores du gel.  [...] Si le papier SDS-PAGE est tant cite c'est surtout parce que le tampon de depot des proteines dans un gel (quel qu'il soit) est le tampon laemmli. Les articles citent en fait la composition du tampon, plus que la methode de SDS-PAGE.  [...]

[Biochimie] DTT et WesternBlot

WesternBlot on ne peut pas plus classique. dénaturation des protéines 10min à 95°C dans du tampon de Laemli (contenant donc du SDS...). Bien sûr SDS-PAGE pour la migration... Donc en conditions dénaturantes.  [...] Alors je me demande vraiment si les étapes de préincubation au DTT étaient nécessaires, pour des protéines de rats je sous-entends (Pour des protéines d'organismes thermophiles par exemple ou autre organisme extrème on aurait pu se poser la QS de savoir si le bleu de Laemmli utilisé couramment induit des conditions de dénaturation suffisantes...).  [...]

[Biochimie] Tampon de charge

Il parait que j'ai un problème de migration de mes protéines (SDS-PAGE). Est ce que je dois arrêter forcément l'électrophorèse quand la ligne bleu (du tampon de charge) atteint le front bas des plaques de verre.  [...] ps. le générateur de courant que j'utilise est ancien type BIO-RAD 500/200 power supply. Et je ne suis pas sur que l'aiguille indique le voltage désiré.   [...]

[Biotechnologie] Culture bactérienne et protéines recombinantes en plaque 96 puits

Je réalise déjà des tests d'expression de protéines recombinantes (sreening des meilleures conditions) mais en format tube...et ça prends beaucoup de place pour gérer la quantité d'échantillons. Habituellement, je réalise une étape de centrifugation à 15000g 30min 4°C en tubes, après la lyse bactérienne via un tampon de lyse commercial, pour séparer les fractions solubles/insolubles et analyser dans quelles fractions se trouvent la protéine produite (par SDS PAGE/WB/ELISA).  [...] Existe t-il un système permettant de séparer les fractions solubles/insolubles directement en plaque 96 puits. Est ce qu'il y a des utilisateurs qui ont l'habitude de faire de la production de protéines recombinantes en plaques.  [...]

[Biochimie] SDS page

Pour le marqueur je n'est pas déposer, mais j'ai utiliser d'autre protéines d'autres collègues et qui ont montrer des bandes sur le gel.  [...] le tampon phosphate permet l'extraction des protéine totales d'une poudre vegetale, au moin tu sera sure de l'existance de votres protéines, en plus c'est un protocol trés simple.  [...]

[Biochimie] tampon de lyse

Qu'est ce qui te fait dire que tes protéines d'intérêt ne sont pas solubilisées par le tampon de lyse Les protéines que tu regardes sont-elles membranaires, localisées dans un sous-compartiment cellulaire particulier, les surexprimes-tu Comment lyses-tu tes cellules (composition tampon, étapes physiques de lyse (choc thermique, piston Dounce, vortex, sonication,...)).  [...] j'ai lysé mes cellules par un tampon de Karla au Bertin,le tampon renferme dees antiprotéase,PMSF,NAF,EAU,Napp.Je cherche aussi bien des protéines membranaire et du stress oxydative certaine sont cytosolique,c'est bisard j'ai fais un dosage BCA j'ai des concentrations trés faible en protéine entre é 2 et 5 mg/ml mais c'est jouable pour déposer en faisant l'éléctrophorése à la fin du transfert j'ai révéler au ponceau il n'ya pas eu de transfert sur ma membrane et effectivement à la révalation d'une protéine j'ai rien vu au chémidoc alors que les marqueurs ont transférer.  [...]

[Biochimie] Interaction protéine/protéine - ultrasons

Ensuite en fonction de ton tissu, il faut le broyer (dounce par exemple) dans ce tampon, centrifuger pour éliminer les débris et récupérer le surnageant. Tu devrais avoir des protéines natives.  [...] ah je ne pense pas que ce genre de tampon soit idéal pour extraire des protéines ancrées à la membrane (pas de détergent fort), mais je ne suis pas un spécialiste de ces protéines.  [...]

[Biologie Moléculaire] Cross-linking

par contre j'aimerai aussi savoir si c'est vrai que le KCl permet d'augmenter la force ionique concernant un band shift( interaction ADN-protéines) le Tris joue t-il le rôle de tampon( comme le PBS).  [...] Pour le Tris, c'est un tampon, mais à la différence du PBS, il n'y pas pas de sel. Donc il faut penser à en rajouter à ta manip pour ne pas dénaturer les protéines. Le tampon tris est utilisé en remplacement du PBS dans les manip ou la présence de tampon phosphate est inhibitrice (par exemple pour des kinations).  [...]

Recepteur à l'insuline en SDS PAGE

Ce n'est pas le tampon de migration qui contient du beta-mercapto, c'est le tempon dans lequel est repris les protéines laemli. Cette etape, denature totalement la proteine (pont S-S compris). Ensuite la presence de SDS permet de faire migrer les protéine uniquement en fonction de leur poid moleculaire apparent.  [...] Ce n'est pas le tampon de migration qui contient du beta-mercapto, c'est le tempon dans lequel est repris les protéines laemli. Cette etape, denature totalement la proteine (pont S-S compris).  [...]

[Biologie Moléculaire] Impossible de récuperer ma protéine GST-X

Lorsque je mets mon tampon de lyse, j'incube toute la nuit à 4°C j'obtiens un leger changement de turbidité puis je sonique pour bien casser tout l'ADN qui pourrait gener mon extraction puis je centrifuge 40 min a 13000 mais lorsque je verifie au bleu de coomassie en passant par gel SDS-page ma protéine reste dans le culot.  [...] - les cellules sont pas lysees. Pas besoin d'incuber tes cellules ON dans le tampon de lyse. Ca devrait aller plus vite que ca, en plus c'est pas top de garder des proteines si longtemps. Utilises un tampon tout bete Tris + lyzozyme a 37 deg 30' puis rajouter du SDS pour une concentration finale de 1%.  [...]