• Forum - Molécule, Template, ADN, Amplification

[Biologie Moléculaire] Connaissez -vous un outil d'analyse d'affinité d'un primer pour une séquence ?

Bien, (rappelez-vous que ma molécule d'ADN est simple brin) je travaille actuellement à une expérience d'amplification par cercle roulant (rolling-circle amplification, RCA).  [...] Mais j'obtiens bien un produit de RCA (observé contre un controle sans molécule template d'ADN = aucune amplification) avec l'une ou l'autre amorce alors que sans le Forward primer, la réaction n'est pas censée se produire avec le Reverse primer seul.  [...]

[Biologie Moléculaire] contamination PCR

Si tu as une bande dans un contrôle négatif, c'est que tu as eu une amplification ce qui veut dire que y avait du template (de l'ADN matrice) dans ton tube.  [...] Mnt, je le répète, si j'étais toi, je referais mon stock de primers car c'est la seule variante entre ton amplification 16S et 18S. Si tu as pas eu de problèmes pour la 18S, tu ne devrais pas en avoir pour la 16S. Le problème vient donc le plus probablement de tes primers.  [...]

Sens d'orientation des brins de l'ADN

Oui, les ARn polymérase étant avant tout des nucleo 3' transferase. C'est le brin complémentaire de l'ADN qui sert de template lorsque le sens du gène est inversé (même si tout dépend de comment l'on regarde).  [...] C'est le brin complémentaire de l'ADN qui sert de template lorsque le sens du gène est inversé (même si tout dépend de comment l'on regarde).  [...]

[Biologie Moléculaire] Solution Q du kit Qiagen

Q-Solution facilitates amplification of difficult templates by modifying the melting behavior of DNA. Use of this unique reagent will often enable or improve suboptimal PCR (see figure Amplification of Difficult Templates with Q-Solution ). Unlike DMSO and other PCR additives, Q-Solution is used at a defined working concentration with any primer–template system and is not toxic.  [...] -les tampons RLT et RW1 contiennent du guanidium isothiocyanate. C'est un sel chaotropique qui en milieu acide et alcoolique attire les molécules d'eau permettant une réaction d'adsorption des acides nucléiques sur la silice. Ici, les particules de silice sont disposées sur colonne et la séparation s'effectue par centrifugation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Amplification infructueuse

J'utilise la Taq de invotrogen, mais dans leur protocol ils prennent un volume total de 100 microlitres, cependant pour le template ils disent juste 1-20 microlitres, (ce qui en soi est une fourchette assez élevée) et ne donnent pas d'indication sur la quantité d'ADN en ng optimale a prendre,  [...] J'ai entendu dire que le plus souvent quand il y a probleme d'amplification (du a la quantité d'ADN, ce qui est juste un hypothese ici) c'était plus souvent du a une surcharge qu'a une sous charge, s'l y a trop de materiel les amorces n'arrivent plus a s'hybrider, de plus dans le protocol ils pronostiquent 1-20 microlitres, (soit 0.  [...]

[Biologie Moléculaire] Dessin de Primer pour qPCR - BLAST

Euhh...Je pense bien au contraire que vous faites trop confiance à cette application. Sachez qu'elle est basée sur Primer3, et qu'elle fait un Blast un fois qu'elle donne les couples d'oligos. Seul certaines occurences sont données, notament celle qui ont un très petite e-value.   [...] Je crois que l'intérêt d'utiliser le bon outil est qu'il est designé pour. BLAST est un programme paramétrable. Afin d'en simplifier l'utilisation par les personnes non versées dans l'informatique il existe plusieurs interfaces disponibles préparamétrées. C'est à dire que des personnes ont réfléchi aux réglages les plus pertinants pour arriver le plus souvent au but qu'ils se sont fixer.   [...]

[Biochimie] Besoin d'aide pour traduire un extrait de biologie

This product, extended by Taq polymérase, was used as template in a PCR to assemble de whole fragment. In this amplification reaction 100 pmol of each primer was used for synthesis of the recombinant S100A12 coding sequence.  [...] A ce qu'il paraît, ils ont fait un premier clonage de la séquence complète. Ensuite, digestion de cette dernière avec NdeI et BamHI ce qui a produit différents fragments. Ceux-là ont été sous-clonés dans 2 différents plasmides, le premier produisant un peptide avec un His-tag et l'autre non taggué.   [...]

[Génétique] Quelques questions diverses

Seulement, l'ARN polymérase peut prendre un brin d'ADN comme template ou l'autre. En fonction qu'elle choisisse l'un ou l'autre, le brin d'ARN sera différent et codera dont pour une autre protéine ce qui n'est pas possible... Ma question est donc. est-ce toujours le meme brin qui est utilisé par l'ARN poly pour servir de template à la formation de l'ARN mes.  [...] Non, il ne s'agit pas de la TATA-box. Je n'ai pas eu le temps de revoir mes cours de L2 et L3, mais je me souviens que le prof avait parlé d'une région riche en A et T où la réplication débute. Ceci est assez logique. étant donné que les liaisons entre A et T sont de nombre de 2 (vs.   [...]

aide pour réaliser les PCR

Globalement c'est 1 minute par étape mais ça dépend pas mal de ce que tu veux amplifier. Par exemple, pour la PCR que j'ai faite il y a 4 jours j'ai mis 15 secondes pour les 2 premiers cycles et l'élongation durait 4 minutes.   [...] Pour tout ce qui est design des amorces et Tm, les logiciels calculent ça automatiquement. Y a même des sites internet où tu rentres ta séquence et tu specifies la zone à amplifier. Ils te trouvent les meilleures amorces et te donnent les statistiques (%GC, Tm, autocomplémentarité...).   [...]

[Biologie Moléculaire] Problème transfo...

Mon ADN template vient de B. subtilis. j'ai eu un doute pendant 10 sec pour savoir si des plasmides de B. subtilis peuvent survivre chez E. coli, mais je me dis que là ça devient de la SF.  [...] Par contre bacillus est un gram+, donc un %GC plus faible que E. coli. Quand je bossais sur une bacterie a faible %GC, j'avais souvent des problemes d'expression (les sequences a haut taux de AT sont souvent reconnues a tort par coli comme etant des promoteurs), voire de mutations, ou de duplications (les ADN/ARN pol de coli n'aiment pas les succession A/T).  [...]