• Forum - Migration, Anticorps, Protéine

QCM - Immunoprécipitation

A-Après migration en gel non dénaturant, on identifie la protéine B dans les complexes retenus par l'anticorps anti-protéine A au poids moléculaire de 2kDa.  [...] C-Après migration en SDS-PAGE et transfert sur nitrocellulose, on identifie la protéine B dans les complexes retenus par l'anticorps anti-protéine A au poids moléculaire de 5kDa.  [...]

[Immunologie] immunoblote

bonsoir, si c possible de m'expliquer le principe d'immunoblote je c que c une électrophorèse qui a un rapport avec un anticorps mais j'ai pas bien compris merci.  [...] Tu dépose l'échantillon protéique sur SDS-PAGE après migration tu fait agir l'anticorps dirigé spécifiquement contre la proteine que tu veux détecter. Cette anticorps est couplé à une enzyme ou un fluorochrome comme sa après lavage si tu detectes l'activité enzymatique ou la fluorescence sa veux dire que l'anticorps est présent est donc que le protéine est présente.  [...]

Recepteur à l'insuline en SDS PAGE

Ce n'est pas le tampon de migration qui contient du beta-mercapto, c'est le tempon dans lequel est repris les protéines laemli. Cette etape, denature totalement la proteine (pont S-S compris). Ensuite la presence de SDS permet de faire migrer les protéine uniquement en fonction de leur poid moleculaire apparent.  [...] Ce n'est pas le tampon de migration qui contient du beta-mercapto, c'est le tempon dans lequel est repris les protéines laemli. Cette etape, denature totalement la proteine (pont S-S compris).  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot / proteine hrp

Je ne comprends pas bien. On peut tout à fait faire un western avec SDS et utiliser un anticorps couplé à la péroxydase. Le SDS agit pendant la migration mais une fois que les protéines sont sur la membrane, il n'y a plus de SDS et si il en reste il disparaît avec les lavages donc aucun problème pour la péroxydase (et d'ailleurs intuitivement ça coule de source car les anticorps que vous allez utiliser, avant la péroxydase, nescessitent leur conformation 3D ce qui prouve que le SDS ne bouleverse pas la manipe une fois que l'on est sur la membrane).  [...] Maintenant vous pouvez tout à fait faire un gel non dénaturant sans SDS si vous voulez garder la conformation native des protéines et conserver les complexes, mais cela n'a rien à voir avec l'utilisation ultérieure d'un anticorps couplé à la préoxydase.  [...]

[Biochimie] Modifications post traductionnelles et électrophorèse !

Non pas à ma connaissance. Pour mes protéines après migration à 80V dans le stacking et 130V dans le separating, je transfère en liquide pendant 1h30 à intensité fixe 350 mA, puis les autres étapes sont inchangées par rapport à d'autres westerns sur d'autres protéines.  [...] Oui mais ça reste toujours une question de taille et non de masse, la masse découlant de la taille de la protéine. Le critère permettant la séparation des protéines est la taille, plus exactement comme disent les biophysiciens le volume hydrodynamique de la protéine qui va déterminer sa vitesse de migration au travers des mailles du gel.  [...]

[Biologie Cellulaire] Dot blot

On ne sépare pas les protéines et la détection peut s'en trouver altérée (augmentation du bruit de fond notamment). Il n'y a pas d'électro-transfert et de ce fait la fixation des protéines sur la membrane est plus faible. On ne peut pas observer de shift de migration ou des migrations à des poids moléculaires aberrants et il est donc impossible de visualiser les modifications post-traductionnelles en utilisant un anticorps dirigé contre la forme totale.  [...] Mais il se trouve quand dans mon cas le signal était spécifique (contrôle avec un mutant nul). Un anticorps peut fonctionner en dot et pas en WB. Ce qu'il y a avec le dot c'est que vous n'avez pas d'information fine. Vous pouvez dire que la protéine est là et parfois quantifier.  [...]

[Biochimie] Electrophorèse en condition dénaturante et native

Alors on réalise une électrophorèse sur la Bêta-Lactoglobuline (une protéine du lactosérum) dans les conditions natives, cette dernière donne une migration en deux bandes A et B d'égales intensités mais ayant des niveaux de migrations différents. Par contre, son électrophorèse en présence de Dodécyl sulfate de sodium (SDS), donne une migration en une bande unique dont le PM est évalué à 18300 Daltons.  [...] Je pense que lors de l'électrophorèse en conditions natives, la protéine est séparée en fonction de sa charge et de son poids moléculaire(PM) d'où la migration en deux bandes A et B. Quant à son électrophorèse en présence de SDS, la séparation de la protéine est en fonction de son PM seulement, je me trompe.  [...]

[Biologie Cellulaire] Western Blot ATM phosphorylé

A la révélation, je n'ai aucune bande ou au contraire quelque fois j'ai des bandes intéressantes mais qui ne correspondent pas à la taille de la protéine (250kDa). (L'anticorps utilisé est celui qui est le plus abondant dans les publications).  [...] Et, ATM est une grosse protéine, très peu abondante. Y a t-il une méthode d'extraction à privilégier de migration et de transfert.  [...]

[Biologie Cellulaire] Qui à déjà utilisé le système SNAP i.d. de Millipore pour ses Western Blot?

En fait apparement c'est un systéme qui optimise le contact entre l'anticorps et la proteine, en faisant passer la solution d'AC à travers la membrane.  [...] Nous l'avons au laboratoire. Et c'est tout aussi miraculeux que cela en à l'air. En une journée tout est fini. Migration, transfert, bloc, anticorps 1er, anticorps 2e, révélation, etc etc... Le résultat sur la table direct.  [...]

[Biochimie] SDS page

aprés extraction des protéines. je n'arrive ppas à obtenir des bandes sur mon gel polyacrilamides. même si je précipite mes protéines avec l'acétone. il faut noter qu'il y à smire (trajectoir) sur mon gel. est ce que quelqu'un peut m'aider.  [...] C'est pas tellement le volume qui compte mais la quantité de protéine. Je trouve aussi que c'est trop de protéine pour avoir une belle migration.  [...]