• Forum - Méthanol, Protéine, Fixation

Différence de fixation des cellules

Bien souvent les différences de résultats entre les modes de fixation dépendent de l'anticorps utilisé et de la protéine visualisée. Certains Ab ne donnent aucun résultat en méthanol et s'utilisent exclusivement en PAF alors que pour d'autres c'est l'inverse.  [...] Avec le methanol, la fixation s'effectue par deshydradation (denaturation des proteines) alors qu'avec les aldehydes (formaldehyde, glutaraldehyde) on conserve la structure 3D de la proteine (fixation par pontage). Donc effectivement, si tu utilises un anticorps conformationnel, la detection de ton antigene sera impossible apres une fixation en methanol.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème immunofluo

quelqu'un aurait de l'expérience en IF voici mon problème. j'ai jusqu'à présent travaillé avec des cellules vivantes en fusion GFP. Désormais je dois faire des IF sur cellules fixées. Pas de problèmes pour un marquage de la tubuline (avec des anticorps) ou pour un marquage actine (avec de la phalloidine), mais pas moyen d'avoir un signal avec ma protéine d'intérêt.  [...] fixation à la PFA, je n'utilise pas de méthanol étant donné que ma protéine pourrait avoir un lien avec le cytosquelette et il me semble que la fixation méthanol n'est pas top pour le cytosquelette... j'ai testé avec ou sans permeabilisation avec du triton, blocage lait ou blocage serum ou pas de blocage.  [...]

fixation des cellules

La fixation PAF te créé des liaisons covalentes entre les NH2 de tes protéines. Le méthanol (perso je l'utilise froid, sortit du congélo -20°C) dénature et précipite tes protéines.  [...] La méthode de fixation par la formaldéhyde va créer des ponts entre les protéines ce qui permet une conservation de la localisation. De plus les lipides ne sont pas solubilisés. C'est pour cette raison qu'il faut perméabiliser tes membranes avant de faire une manip d'immuno par exempl.  [...]

[Biologie Moléculaire] Gène0 AOX1!!

Lorsque méthanol est abscent les facteurs de transcription changent de configuration et bloquent l'opérateur du promoteur. La synthèse de la proteine n'a pas lieu. Car ARNpolymerase ne peut s'attacher au promoteur suite à la modification de configuration des proteines indispensable à l'initiation de la transcription.  [...] Lorsque méthanol est présent elle se lie avec la proteine crée par le gène répresseur de AOX1. Cette liaison modifie la configuration de la proteine qui ne parviens plus à se fixé sur l'oprérateur du promoteur. Comme la proteine de répression ne se fixe pas la transcription a lieu.  [...]

[Biologie Cellulaire] /[biochimie] demande de conseils pour la fixation de cellules

Mon problème est que je n'ai pas de marquage spécifique ni en fixation PFA ni en fixation méthanol. J'ai tenté de faire des perméabilisations TritonX100 0,1% ou 2%. ou SDS 0,1% ou 0,5% ( sur chaque mode de fixation)...rien mis à part un bruit de fond faible sur l'ensemble des cellules.  [...] Je viens de tomber dans la littérature sur un papier dans lequel ils observent la même protéine que moi. Ils le font sur des coupes de tissus en cryostat, fixées en éthanol 100% 4°C 30min puis acétone -20°C 3min puis ils font sécher la coupe et la réhydrate avec du PBS. Enfin ils perméabilise en TX100 0,2%.  [...]

[Biochimie] Electrophorèse SDS-page

Pour la fixation des protéines sur mon gel. le méthanol et l'acide acétique.  [...] Ce qui aide à la dénaturation des protéines est l'SDS ou encore le beta-mercaptoéthanol, enfin d'après mes connaissances ^^.  [...]

[Biologie Moléculaire] Etalement chromosomique

Je voudrais réaliser un étalement chromosomique puis fixer les cellules avec une fixation de Carnoy (1/3 A. acétique, 2/3 méthanol).  [...] Plus précisement, acide acétique ne risque t-il pas de me faire perdre des protéines (dasn mon cas histone et protéine du kinetochore).  [...]

Migration SDS PAGE

Je suis ce protocole depuis toujours pour la migration des gels en tampon MOPS (protéine standard), et je n'ai aucun soucis. Le fait de passer en tampon MES (protéine de faible poids) me donne des gels illisibles.  [...] Je fe fais pas de fixation du gel au méthanol ou autre à part juste coloration au bleu et décoloration à l'eau tiède (qui marche très bien en tampon MOPS).  [...]

[Biochimie] Fixer des protéines dans un gel

Par contre, dès que j'essaie de les fixer (avec du TCA, par exemple), là, je perds carrément les petites protéines (diffusion dans le tampon de fixation + dans les lavages, probablement), et les grosses sont également plus faibles.  [...] Je vais du coups tenter un peu un mix de ce que vous me proposez, avec une déshydratation/fixation du gel au méthanol suivit d'une pulvérisation du tampon de fixation (formaldéhyde avec éthanol), puis lavage (ou pas, je vais tester)... Je vous tiens au courant, mais ce n'est pas pour tout de suite (une autre expérience en parallèle...).  [...]

[Biotechnologie] Bloquer l'expression d'un gène chez la levure

Pour l'IPTG je ne suis pas certain qu'il fonctionne chez la levure... je rappelle a toute fin utile que c'est un promoteur bacterien. y'a peu de chance qu'il fonctionne dans la levure, surtout qu'il necessite la presence de la protéine LacI pour etre réprime.  [...] je veux induire l'expression de ma proteine chez la levure pichia normalement cette proteine doit etre excreté hors de la levure.j'ai fait un preculture dans le BMGY et apres dans le BMMH( 0.5% methanol) à 30°c.  [...]