• Forum - Ménage, Référence, échantillon

[Biologie Moléculaire] Calibration qRT-PCR sur cellule unique

Je me demandais dans le cas où l'on réalise une qRT-PCR sur les ARNm provenant d'une cellule unique, est ce qu'on doit partir de la même quantité d'ARNm pour tous les échantillons ou comme c'est les ARNm d'une seule cellule on peut s'affranchir de ce biais puisque l'on compare les niveaux d'expression d'un gène d'une cellule à une autre ( la variabilité des quantité d'ARNm serait inter-cellules) et bien sur en utilisant un gène de ménage comme référence pour chaque échantillon. Je ne sais pas si j'ai été claire.  [...] Là, vu qu'on aurait une base commune qui serait la cellule, et qu'on aurait pas d'inhibition de la réaction, on pourrait surement s'affranchir de cette étape.   [...]

Gène de ménage (gène de référence...)

dans 3 échantillons (une référence, une condition 1 et une condition 2) on avait une quantité totale d'ARN égale mais une quantité d'ARNm à quantifier et d'ARN du gène standard en quantité différente. Ok, mais, comment on a introduit l'ARN standard dans l'expérience.  [...] Ce que tu vas donc faire c'est faire une qPCR pour quantifier le TGFB et un gène de ménage (ex. GAPDH) dans chaque échantillon. Ensuite tu vas faire le delta CT entre la Ct du TGFB et celle de la GAPDH. Etant donné que tu as la même quantité totale d'ARN dans tes échantillons la Ct de la GAPDH ne devrait pas beaucoup changer (puisque c'est ton gène de référence) par contre celle du TGFB oui.  [...]

[Biologie Moléculaire] qPCR

Le Delta et Deltadelta de Ct permet de faire la normalisation. Normalement pour la qPCR il y a une condition contrôle et un gène de référence (de ménage) comme le GAPDH par exemple.  [...] Cela est juste une normalisation, le gène de référence DOIT être le même entre la condition contrôle et la condition expérimentale.  [...]

pcr quantitative et standard interne

J'ai compris le principe de la pcr (amplifier un fragment d'ADN ou d'ARN). Mais qu'est ce que la PCR quantitative c'est la taille du fragment amplifié que l'on veut connaitre, c'est ca et quel rapport avec la notion de standard interne (j'ai noté dans mon cours que le standard interne est un gène présent dans ttes les cellules et qu'il a pour but de corriger les erreurs O_O).   [...] Ainsi, un gène peut être très exprimé dans un tissu à un instant t ou peu exprimé. Si tu n'as pas de référence, difficile d'en faire la différence. Tu utilises donc un standard interne. On utilise en général un gène dit de ménage. En fait c'est un gène, comme pour la tubuline, qui s'exprime tout le temps, de la même manière quelque soit le tissu, la cellule ou le temps. J'espère que ça t'aide.  [...]

Housekeeping gene (gene de ménage)

Oui mais est ce que justement on pourrait faire une normalisation, en se disant qu'une certaine quantité d'ADN génomoque correspondrait à une quantité de cellules donnée dans chaque échantillon.  [...] Ce que j'ai envie de faire c'est de d'amplifier un gène de ménage (spécifique à l'Homme) dans un volume d'échantillon de sang donné puis amplifier le même gène dans le même volume d'échantillon de selle, puis faire une normalisation par dilution des quantités d'ADN. Qu'en pensez vous.  [...]

[Biologie Moléculaire] Q-CPCR encore !

Si tu as utilisé la même quantité d'ARN pour les 2 RT, alors c'est que tu as bien un différence. Par contre si tu avais pris x ul de chaque échantillon pour faire la RT, alors la il faudrait normaliser par la quantité d'ARN utilisé.  [...] En theorie, si ton (tes) gene(s) de menage est solide, tu n'as meme pas a quantifier l'ARN au depart puisque ton gene de menage va te normaliser tes resultats entre tes differents echantillons. En plus, c'est nettement plus precis qu'une quantification par la DO280 qui va quantifier a 95% des ARN stables et non pas des messagers.  [...]

Calcul de ratios en real time RTqPCR: Combinaison de gènes de référence.

Pour le calcul du Ratio de mon gène A par rapport au gène de ménage sur un échantillon, et normalisé par rapport à mon calibrateur.  [...] Je me suis rendu compte que le niveau d'expression en ARN de GAPDH n'est pas stable d'un échantillon à l'autre, j'ai ajouté deux autres gènes de référence (ESD et PLOR2A).  [...]

[Biologie Moléculaire] Comparaison de plaque qPCR

En effet, les valeurs de CT et MT entre mes plaques (pour une même espèce toujours) de mes échantillons de références diffèrent légèrement, j'aimerai donc savoir comment je peux tenir compte de cette différence et la reporter sur mes autres valeurs.  [...] A chaque fois j'ai mis 8 marqueurs par plaque (les même sur la plaque 1 et sur la 2). J'utilise 1 seul gène de ménage et des échantillons qui servent de références.  [...]

[Biologie Moléculaire] Gammes pour calcul de l'éfficacité de la RT-qPCR

dans le labo je fait mes calculs de quantité relative sans le calcul de l'efficacité, cet-à-dire, j'utilise E=2 (efficacité = 100%), mais si je veux faire ces calculs de la quantité relative avec la vrai éfficacité ( E differente de 2), je peux utiliser la même formule R=E^-deltaCp sauf que en se cas le E est differente de 2.   [...] L'efficacité est propre a un protocole donné, c'est à dire amorces, mix réactionnel et programme d'amplification. La seule façon de calculer l'efficacité d'une PCR est de faire une gamme de concentration en parallèle des échantillons pour chaque couple d'amorces utilisé.  [...]

[Immunologie] Normalisation de données issues d'un séquençage NGS (ARN)

Le principe de la normalisation des données, c'est qu'au cours du processus d'extraction, purification, RT, etc, tu peux perdre une fraction significative de tes ARNs. Du coup, d'un échantillon à l'autre, les quantités d'ARNs varient totalement. Mais les rapports de concentrations entre gènes (au sein d'un réplicat), ou de gènes de ménages au sein de ton expérience, ne changent pas.  [...] Ce que ces algorithmes effectuent, c'est rechercher un groupe de gènes, dits gènes de ménage dont les rapports de concentration sont les mêmes au sein des réplicats et également entre les échantillons. Une fois ceci fait, toutes les concentrations des autres ARNS sont normalisées par ces gènes de ménage, ce qui permettra d'identifier des changements.  [...]