• Forum - Membrane, Transfert, Rouge

[Biochimie] migration sds page

Après la migration, je fais un transfert et je vérifie ensuite par du rouge ponceau la qualité de la migration et du transfert. Ensuite je fais une marquage anticorps. Le problème est donc que je ne fais pas de photo au ponceau, je le rince direct et je sature ma membrane pour la révélation.  [...] Je commence par vérifier la qualité du transfert par une coloration rouge ponceau, et c'est là que je me rends compte de la qualité de la migration de mes protéines. Après le rouge ponceau je rince la membrane dans du PBS et je fais une immunorévélation de ma (mes) protéines d'intérêts.  [...]

[Biologie Moléculaire] Vérification transfert W.Blot

L'utilisation d'un marqueur de poids coloré permet aussi de s'assurer immédiatement que le transfert s'est bien déroulé (i.e. que les protéines ont été transférées sur la membrane), mais ne montre pas que le transfert a été homogène sur toute la membrane à l'inverse du rouge ponceau.  [...] Sinon, si tu veux absolument contrôler le transfert sur ta membrane et faire un immunoblot derrière alors il faut passer au rouge ponceau dont je parlais plus haut. Le rouge ponceau est une coloration labile qui te permettra de faire ta réaction immunitaire derrière.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot Transfert sur membrane

Oui c'est ça je mets 3 membranes les unes sur les autres...et là j'ai des bandes bleues sur les 3 (les bandes de fin de migration) mais qd je les mets dans le rouge pinceau je vois aucune bande donc pas de transfert de protéine Ou un over transfert.  [...] Si ton marqueur est transféré, c'est que le transfert fonctionne. Quelle quantité de B-actine déposes tu à migrer Parce que le rouge ponceau a une limite de détection de 250ng et il ne fonctionne pas terrible avec les membranes en PVDF.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot avec membrane PVDF

Je transférais mes protéines sur une membrane de nitrocellulose (transfert semi-sec avec Trans Blot Turbo System de Bio-rad) mais j'ai testé depuis peu la membrane de PVDF (même méthode de transfert). J'ai incubé mes membranes avec plusieurs anticorps primaires (toujours les même anticorps et 1 anticorps primaire/membrane).  [...] J'ai déjà entendu dire que la membrane de PVDF pouvait mieux retenir certaines proteines, est- ce le cas Avez-vous déjà rencontré ce problème et si oui, comment peut-on éviter au mieux d'avoir un signal aspécifique.  [...]

[Biochimie] Transfert western blot raté

Le problème est que je souhaite confirmer que la bande présente sur mon gel est bien celle de ma protéine, donc je réalise un WB afin de localiser spécifiquement ma protéine d'intérêt. J'ai un gros soucis lors du transfert de ma protéine du gel vers la membrane PVDF.  [...] Apres activation, tu as mis équilibrer ta membrane dans le tampon de transfert (Les tampons de transfert doivent être à 4°C).  [...]

[Biochimie] Questions Western Blot

Merci pour ton message mais il ne répond qu'à la première de mes question puisque le site ne traite que de la partie électrophorèse et pas du transfert sur membrane.  [...] - si l'activation de la membrane la rends hydrophile et est utile pour le transfert. pourquoi faudrait-il la réactiver avant de repasser un anticorps dessus.  [...]

[Biochimie] bruit de fond western blot

La seule contrainte c'est qu'il faut mouiller la membrane dans du méthanol avant le transfert. Mais sinon moi je n'utilise plus que ça.  [...] Je sais que nous on réutilise le méthanol dans lequel on a trempé la membrane car apparemment on a pas le choix d'utiliser du méthanol par contre pour le tampon de transfert, on peut utiliser de l'éthanol à la place du méthanol.  [...]

[Biochimie] le native PAGE !! et western blot "natif"

j'aurais voulu savoir si quelqu'un par ici a l'experience du native PAGE et surtout du transfert sur membrane derrière.  [...] en effet j'ai une proteine positive à faire migrer pour cela j'avais inversé les bornes lors de l'electrophorèse afin qu'elle puisse migrer tranquillement vers le moins et pareil lors du transfert (sauf que la j'avais inversé la membrane et le gel) et le resultat à la fin est assez surprenant vu que mon anticorps semble detecter quelque chose mais ca ne donne pas des bandes mais on dirait juste une membrane degueu.  [...]

[Biochimie] gros loading de protéine pour un western blot

J'utilise un kit invitrogen pour la migration sur gel et un transfert sur membrane selon la méthode Laemli (transfert par diffusion sur 2 membranes).  [...] 60µg c'est vraiment beaucoup. L'expérience montre que si l'on charge trop un gel la migration est pourrie et la détection marche mal. C'est ainsi que parfois, quand on y arrive pas il vaut même mieux diminuer la quantité de protéines chargées plutôt que de l'augmenter.   [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot difficile d'une protéine de réparation de l'ADN

Il est aussi question dans l'article de bloquer le gel de migration (, jamais vu ça ) avant le transfert sur membrane de nitrocellulose, qui est également bloquée après le transfert.  [...] Après, il faut également se rendre compte que tu gardes (et fait migrer) également les lipides de la membrane et l'ADN. Ca pollue et peut interagir.  [...]