• Forum - Membrane, Protéine, Intérêt

western-blot

tu peux couper ton gel en deux. Une partie de ton gel va être colorée au bleu de Coomassie et l'autre partie va être transférée sur membrane. tu peux grâce à la coloration au bleu déterminer si tu as déposé une quantité équivalente de protéines sur gel.  [...] L'autre solution est d'hybrider ta membrane avec un second anticorps. qui va reconnaitre une protéine témoin (style l'actine si bien sur la taille de ta protéine témoin n'est pas la même que celle de ta protéine d'intérêt).  [...]

[Biochimie] bandes parasites aprés révélation western-blot

mon éluat final d'IP contient l'Ac que j'ai utilisé pour réaliser mon IP et bien sur ma protéine d'intérêt, je réalise ensuite un SDSpage et un western sur la nuit, je révèle mon blot à l'aide de l'Ac que j'ai utilisé pour mon IP ainsi qu'avec un Ac-HRP dirigé contre mon Ac d'IP, je bloque la membrane avec lait écrémé 3%.  [...] apré révélation du blot à l'opti 4CN (biorad) je retrouve bien ma protéine d'intérêt (IP fonctionne) ainsi que la bande haute et basse de mon Ac spécifique de ma protéine, mais si je laisse le blot révélé plus longtemps, je vois apparaitre d'autres bandes autour de celles de l'Ac (révélation du blot ~2min) ces bandes sont elles dû à un mauvais blocage de la membrane utilisation d'un Ac-HRP polyclonal comme Ac secondaire.  [...]

[Biologie Moléculaire] Purification d'un serum à partir d'une membrane de nitrocellulose

Dans le cadre de mon mastére, je me propose de purifier un serum à partir d'une membrane de nitrocellulose,l'anticoprs j aurais à l utilisé pour une chromatogrphie d'affinité pour purifier une proteine periplasmique.  [...] Donc en gros, je fais migrer un echantillon contenant la proteine toxoplasmique P30 par SDS-PAGE puis aprés transfert, saturation et incubation avec un serum (à purifier) je coupe une portion de la membrane qui correspond a la proteine d interet et j utilise un tampon d elution pour eluer les anticorps a partir de la membrane.  [...]

Technique pour intégrer une protéine chimère dans la membrane externe?

Je cherche à savoir s'il est possible, à partir de la séquence nucléotidique d'une protéine d'intérêt ( possédant les carractéristiques membranaire ), d'ajouter une séquence tag, lui permettant d'être intégrée à la membrane extracellulaire, et si oui, comment gérer son orientation d'intégration.  [...] Oui je pense que c'est possible. Il suffit de lui mettre une bonne séquence d'adressage en Nt. Pour l'orientation il me semble que ca va dépendre beaucoup du nombre de segment TM que possède ta protéine. Mais le mieux serait de lui mettre les signaux provenant d'une protéine qui à l'orientation que tu désires.  [...]

[Biochimie] Normalisation de la quantité de protéine Western Blot

Et bien tu utilises un anticorps dirigée contre ta protéine de normalisation comme l'actine, la tubuline, le GAPDH... pour révéler sur la même membrane où tu as révélé ta protéine d'interêt. Si tu as déposé la même quantité de protéine dans les puits, ta protéine contrôle va te permettre de le confirmer visuellement.  [...] Même si le western n'est pas une méthode quantitative il est aussi possible de mesurer l'intensité de tes bandes avec un logiciel, et de normaliser ta prot d'interêt par rapport à ta protéine contrôle mais en général on se contente du visuel.  [...]

[Biochimie] Différence western blot / immunoprécipitation

Ensuite on peut mettre la protéine isolée sur un gel d'électrophorèse puis une membrane pour révéler sa présence (ou non) avec un anticorps.  [...] Du coup cette raison me semble valable et j'y avais pensé, c'est mieux d'avoir la seule protéine sur la membrane plutôt que toutes les autres avec, même si l'anticorps n'est censé révéler que la protéine d'intérêt.  [...]

[Biochimie] Transfert western blot raté

Je souhaite induire une protéine à partir d'un système procaryote (en E.coli) grâce à l'IPTG. J'ai donc fait des tests d'inductions sur des petits volumes de culture (5ml). J'ai lysé mes bactéries puis déposé la fraction totale sur gel SDS-PAGE. Après coloration j'ai pu déterminer que ma protéine d'intérêt était induite (taille estimée 74 kDa).  [...] Le problème est que je souhaite confirmer que la bande présente sur mon gel est bien celle de ma protéine, donc je réalise un WB afin de localiser spécifiquement ma protéine d'intérêt. J'ai un gros soucis lors du transfert de ma protéine du gel vers la membrane PVDF.  [...]

[Biologie Moléculaire] Techniques de transfert

La technique utilise l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour séparer les protéines, préalablement dénaturées, selon leur masse. Les protéines sont ensuite transférées depuis le gel sur une membrane (typiquement en nitrocellulose), où elles sont exposées à un anticorps spécifique de la protéine d'intérêt.  [...] Il est possible grâce à cette technique de détecter la présence d'une protéine dans un tissu, d'évaluer sa taille, sa concentration, les variations de cette concentration, effectuer des comparaisons de concentrations entre différents groupes, etc.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot "semi-quantitatif", pourquoi??

J'utilise la technique du western blot afin de quantifier mes protéines d'intérêt (par chemiluminescence, révélation par l'ECL+ et analyseur d'image permettant de quantifier mes blots), mais une question se pose à moi. pourquoi dit-on du western blot que c'est une technique semi-quantitative Quelles sont les limites de la quantification.  [...] On streap la membrane et on effectue un immunomarquage de la protéine d'intérêt. Vous ne savez pas combien vous avez de protéine dans l'absolu. Mais le rapport prot d'intérêt/actine dans chacune des puits vous permet de dire qu'il y en a plus là que là. C'est relative ou encore semi quantitatif.  [...]

fusion transcriptionnelle et traductionnelle

la fusion traductionnelle est une fusion de gênes effectuée dans leur partie codante et respectant les cadres de lectures. Permet d'obtenir une protéine chimère. cette technique permet par exemple de faire une fusion entre un gène d'intérêt ( qui code pour une protéine d'intérêt ) et le gène qui code pour la GFP.  [...] à propos d'une fusion traductionnelle, j'imagine qu'on peut l'utiliser pour isoler une protéine d'intérêt ou bien réaliser une fusion entre une protéine d'intérêt et la GFP ( pour visualiser et localiser le chemin emprunté par la protéine dans la cellule ) je me trompe.  [...]