• Forum - Mélange, Volume, Amorces

Biologie moléculaire: calcul volume d'amorces

J'ai besoin d'aide. j'ai 2 amorces, une F à une concentration de 2micoM et une amorce R a une concentration de 8microM. Les 2 amorces sont en mélange dans un volume de 0,70microL. Mais je souhaiterai savoir quel est le volume des amorces quand elles sont séparés.  [...] Au départ mes amorces sont bien séparés, chacune dans un tube à une conconcentration de 100 µM. Mais dans mon protocole elles sont en mélange et c'est pour sa que je veux savoir quel volume il faut prendre pour chacune des amorces à 2 µM et à 8 µM.  [...]

[Biologie Moléculaire] le diagnostic par RT-qPCR multiplexe : problèmes de lecture des fluos!

J'ai d'abord mis au point les simplex de façon indépendante. J'ai ensuite testé le tout en multiplex. Cela fonctionne toujours bien mais il y a quand même un problème. lorsque je mélange les 4 ARNs avec leurs 4 couples amorces/sondes il n'y a pas de soucis.  [...] Par contre, lorsque je mélange les 4 couples amorces/sondes + 1 SEUL ARN et bien la machine sort des CT dans les canaux correspondant aux autres ARNs non présents dans le mélange. Je précise que tout les éventuels problèmes de spécificité avaient été testés au préalable in silico mais aussi en manip.  [...]

[Génétique] Problème de sequençage

Je reviens vers vous pour m'aider à dépasser un problème dans le séquençage, enfait j'ai eu beaucoup de difficultés pour avoir un produit PCR, j'ai utilisé 360 CG enhacer pour eleminer les bandes non spécifiques, et la bande de ma pcr était faible, j'ai séquençé quand même, mais j'ai rien, la taille est de 1800 pb.   [...] Pour les amorces, j'ai pris un volume de 0.16 ul d'une concentration de 10 uM.  [...]

[Biologie Moléculaire] CT variable

je suis en stage en M2, j'ai comme objectif de mesurer la variabilité de l'expression de certains gènes d'intérêt, pour cela j'ai dessiné des amorces qui ciblent ces gènes dans différentes espèces bactérienne. Je suis entrain de faire la validation des amorces j'ai donc fais une gamme étalon avec 5 différentes dilutions de mon échantillon ( facteur de dilution 2), et de différentes concentrations d'amorces dans le mélange réactionnel.  [...] les dilutions les plus grandes sont bien censé sortir plus tard, si ce n'est pas le cas, tu as du te tromper, car tes amorces ont la même efficacité dans tous tes puits ducoup elle ne peuvent pas bosser plus rapidement ou plus lentement selon le puit, si l'efficacité e tes amorces est de 2, elle est de 2 partout.  [...]

Quantification d'ADNc après une reverse transcription

-La quantification au nanodrop est souvent exclue parce que les amorces et les dNTP faussent la valeur. Mais si l'on fait le blanc avec un mélange d'oligo et dNTP équivalent à celui dans lequel l'ADNc est en solution, est ce que ça ne rectifie pas grossièrement ce biais.  [...] Ca dépend du système utilisé, du volume et de l'enzyme. Par exemple une Superscript II fonctionne très bien même au dessus de 2 µg dans 20µL.  [...]

[Biologie Cellulaire] Quelle est la définition de la vie ? - Page 2

Alors si un virus est vivant, quand est-il de mes fragments d'ADN que je mélange avec l'ADN polymérase et des amorces pour faire ma PCR.  [...] Cette vision des choses elle ne tient plus si on change de perspective et si on considère que le virion n'est pas le virus. C'est Jean-Michel Claverie qui, il y a deux ans, a publié un papier dans Genome Biology dans lequel il a insisté sur cet aspect. Mais un chercheur américain, Claudiu Bândea, avait déjà publié en 1983 dans Journal of Theoretical Biology, un petit peu la même idée, à savoir que vraiment ce qui est important dans le virus, c'est sa phase intra-cellulaire.   [...]

[Biologie Moléculaire] Genotypage d'arabidospis thaliana

J'ai donc mis, dans mon melange à pcr, des amorces pour permette l'amplification de GAI ( 400 pb) et de gai (350pb ). Jusque là tout va bien.  [...] La seule hypothèse que je trouve est que les amorces du gene gai ont amplifier une autres sequence non voulues ( car j'ai fait la meme chose pour les allele ald1 et ALD1 et il n'y avait pas de bandes ' parasite ' ).  [...]

[Biologie Moléculaire] Point de protocole

La purification sur gel permet d'une part d'éliminer les amorces ayant servis à faire les 3 PCR indépendantes. Si elles étaient présentent dans la dernière PCR, tu aurais toutes les possibilités de PCR entre les différentes amorces, ca ferait un beau mélange.  [...] Pour une précipitation (ce que je crois que tu entends par centrifuger pour avoir un culot), ca peut être une idée, à condition d'avoir les conditions qui ne précipitent que les fragments long et pas les amorces. Mais perso je préfère la technique sur colonne.  [...]

PCR et vecteur de clonage

Mais tu dois de toute façon connaître un minimum la séquence que tu veux amplifier de manière à pouvoir élaborer tes primers (=amorçes qui vont encadrer la séquence à amplifier sur chacun des 2 brins). Dans le cas d'espèces peu connues génomiquement parlant, tu peux utiliser une sauce d'amorçes dégénérées qui va être un mélange de primers permettant une hybridation plus ou moins efficace avec ta séquence cible (c'est très simple à comprendre avec un shèmas.).  [...] Tu peux faire une PCR avec des amorces spécifiques d'une séquence pour en vérifier la présence dans un ADN donné. Par exemple à la suite d'un clonage, après sélection des transformants sur antibotiques/marqueur, avec des amorces spécifiques à l'insert, tu peux rechercher les transformants dont le vecteur a intégré l'insert d'intérêt.  [...]

[Biologie Moléculaire] Dilution PCR

Sinon, classiquement les dNTP sont préparés en un mélange 10mM, dilués de sorte à être utilisés à 1mM. Dès lors ce n'est pas bien sorcier. 10mM -. 1mM dilution d'un facteur 10. Si votre volume réactionnel est de V, vous mettez V/10 de votre solution stock.  [...] oui c'est ca. Ex. ton tube d'amorces est a 10µM, et tu dois avoir une concentration finale de 500nM. Combien en prélèves tu sachant que le volume réactionnel total est de 50 µL.  [...]