• Forum - Marquage, Quantité, ADN

Besoin d'avis pour optimiser extraction d'ADN à partir de tissu FFPE en vue d'une CGH

Dans le cadre de mon stage de Licence, je suis censé, dans un CHU, développer une méthode de CGH sur tissus FFPE (les profils, observés à l'aide du logiciel CytoGénomic, sont ininterprétables). Je dispose donc d'un protocole de base, mais, ayant commencé les manips cette semaine, malgré une extraction ayant conduit à une quantité plus que suffisante d'ADN (déterminée au nanodrop), notre marquage à la cyanine (random priming) à très mal fonctionné sur l'ADN du patient.  [...] ps. me confirmez vous que le Nanodrop me permet d'identifier la présence de contaminants et la concentration d'ADN, mais pas sa qualité Raison pour laquelle j'ai besoin du Qubit...en gros, il faudrait peut être que je réalise mon protocole à partir d'une plus grande quantité d'échantillon, afin d'obtenir plus d'ADN de bonne qualité, pour que le marquage en random-priming fonctionne.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment pRb peut-elle augmenter l'activité d'un promoteur ?

Grâce à une méthode de marquage d'un seul des 2 brins d'ADN suivie d'une digestion avec une très faible quantité de DNase d'ADN incubé avec C/EBP5 seul ou C/EBP5+Rb on conclut que c'est 2 facteurs se fixent sur un même module.GC.  [...] La première expérience consiste à digérer l'ADN de façon aléatoire. la DNase va donc couper partout, sauf là où est fixé le ou les facteurs. On a donc des fragment de toutes tailles. Ensuite un trou est visualisé par électrophorèse, qui correspond à l'endroit où se fixe le facteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] pb migration ADNg sur gel

Par contre, merci pour l'hypothèse de la dilution du marquage en augmentant la quantité d'ADN, je n'y avais pas pensé une seule seconde. Je vais voir en déposant moins d'ADN.  [...] Je n'ai aucune idée de la quantité (µg, ng...) a déposer sur un gel d'agarose pour vérifier la présence d'ADNg...Au labo on m'a répondu de déposer 5µL, mais ça ne me donne pas la quantité d'ADN.  [...]

Cycle cellulaire et cytofluorimétrie

regardez la photo. http.//membres.lycos.fr/ikramer/images/1.6b.jpg correspond a la quantité d'ADN dans une cellule en fonction de chaque phase de l'interphase, je ne comprend pas pourquoi quand on passe de G1 à G2 il y a diminution de la quantité d'ADN alors que la quantité d'ADN a nécéssairement doublé lors de la phase S.  [...] par contre je comprend pas comment tu vois que le marquage est plus ou moins fort. j'arrive pas a voir la distinction entre G1, S et G2. et la concentration en marqueur marque la quantité en ADN c'est ca.  [...]

[Biologie Moléculaire] Marquage directe et indirecte d'une sonde ADN

[Biologie Moléculaire] Marquage directe et indirecte d'une sonde ADN.  [...] Ma question est a propos du marquage directe et indirecte dune sonde ADN. Le prof nous a dit que le marquage indirecte est utilise pour amplifer le signal mais je n'ai pas compri pourquoi une necessité d'amplifier le signal.  [...]

[Biologie Cellulaire] Fréquence des divisions cellulaires ?

Il faut aussi considéré qu'une cellule cancéreuse zape les points de contrôle visant, entre autre, à réparer l'ADN. De plus une cellule normal cesse de se diviser après une cinquentaine de division, alors que la cellule cancéreuse se divise tant qu'elle peut.  [...] l'index de marquage. on ne dénombre plus les figures de mitoses mais on quantifie la présence d'un marqueur incorporé dans l'ADN au cours de sa réplication.  [...]

[Biologie Cellulaire] Internalisation et trypsine

une cellule est positive quand elle a internalisé une molécule fluorescente, donc il y a eu endocytose. et parmi les cellules qui ont endocyté, on regarde la quantité de molécules florescentes internalisées.  [...] (puisque 100% des cellules sont marquées). Le seul point intéressant est la variation de l'intensité du marquage (la quantité de peptide fluo attaché à la cellule).  [...]

[Biologie Cellulaire] marquage au BrdU

je ne comprends pas vraiment le principe du marquage au BrdU de l'ADN. je sais que ce marqueur remplace la thymine pendant la synthèse de l'ADN. du coup peut on le considérer comme un uracile.  [...] Ca a été montré en faisant des brefs pulses de BrdU à différents temps, et en regardant plus tard par immuno quelles couches du cortex étaient marquées.  [...]

gel shift : hhhheeeeelllp !!!!!!!

g qd même encore une petite question...je sais qu'il faut faire des expériences de compétition sonde chaude/sonde froide pour tester la spécificité de l'interaction ADN/prot... s'il y a des aspécificités, est-ce dû au marquage de la sonde.  [...] je pose cette question car dans le cas de l'utilisation du kit dont je parlais la derneiere fois, on ne peut pas réaliser d'expérineces de compétition car c le gel qui est coloré apres l'electrophorese et il n'y a pas de marquage de sonde d'ADN, donc je ne vois pas pourquoi l'interaction ADN/prot serait non spécifique dans ce cas.  [...]

mesure de l'expression d'un gene

Pour les techniques de marquage métabolique ou de western, les questions ne sont pas du tout les mêmes. L'un permet d'estimer la quantité de protéine synthétisée (attention aux protéines instables et rapidement dégradée), l'autre c'est la quantité de protéines présente à un temps donné (néosynthèse ou pas, dégradation ou pas).  [...] Enfin pour le marquage métabolique, je ne supprime pas le biais de la stabilité de la proteine c'est vrai, mais je ne mesure plus que les proteine traduites pendant un temps donné et non pas la quantité totale dans la cellule. Si j'inactive le protéasome je peux optimiser ma mesure c'est cool ça.  [...]