• Forum - Marquage, Protéine, Intérêt, Anticorps

[Biologie Cellulaire] Problème immunofluo

quelqu'un aurait de l'expérience en IF voici mon problème. j'ai jusqu'à présent travaillé avec des cellules vivantes en fusion GFP. Désormais je dois faire des IF sur cellules fixées. Pas de problèmes pour un marquage de la tubuline (avec des anticorps) ou pour un marquage actine (avec de la phalloidine), mais pas moyen d'avoir un signal avec ma protéine d'intérêt.  [...] L'anticorps marche bien en WB et la personne ayant précédemment travaillé dessus avait un signal qui semblait cracher à fond. J'ai suivi son protocole à la lettre mais pas moyen Pourrais-il y avoir un problème avec l'anticorps secondaire.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème marquage Actin par la Phalloidine

Je réalise marquage de ma protéine d'intérêt avec un anticorps primaire, puis un secondaire couplé au fluorophore.  [...] Ensuite je réalise un marquage de l'actin en utilisant de la phalloidin couplé à un fluorophore. Je ne parviens pas à obtenir un marquage correct de l'actin. Mon maitre de stage pense que je réalise trop de rinçage après la phalloidin (alors que c'est dans son protocole).  [...]

[Immunologie] Anticorps relevant

dans un contrôle négatif, on utilise plutôt une anticorps irrelevant (c'est à dire qui ne reconnait rien qui a un intérêt pour toi on pourrait le traduire par non pertinent), en immunomarquage on utilise plutot le terme de contrôle isotypique. ex si tu veux révéler une protéine X, et tu utilises un marquage direct avec un anticorps IgG1 de souris anti-X couplé FITC, tu utilises en contrôle une IgG1 de souris irrelevante-FITC (qui ne reconnait rien dans ton système, ces molécules sont vendues sous le nom de contrôles isotypiques).  [...] oui à ce moment là l'anticorps contre la protéine d'intéret est l'anticorps relevant. mais enfin c'est un peu bizzare comme langage.  [...]

[Biologie Cellulaire] Notion de contrôles, contrôles isotypiques, culture cellulaire

Pour moi, il s'agit d'un contrôle permettant la vérification de l'absence de fixation non spécifique d'un anticorps, que l'on effectue en incubant une IgG dirigée contre une protéine jamais exprimée dans la cellule qui nous intéresse. Ainsi, on vérifie l'absence de fixation non spécifique et donc la spécificité du marquage effectué avec l'anticorps dirigé contre la protéine que l'on veut localiser.  [...] Bah si l'anticorps qui cible votre protéine d'intérêt est un IgM, l'anticorps contrôle doit être un IgM. Si il s'agit d'un IgG, le contrôle doit être un IgG.  [...]

[Biologie Cellulaire] Immunofluorescence

Pourquoi voulez vous faire le couplage vous même On trouve des anticorps commerciaux déjà couplés. Pour le choix du fluorochrome c'est à vous devoir avec les filtres dont vous disposez. Chez nous, par exemple, on utilise souvent Cy3 en première intention.  [...] L'anticorps secondaire pourra être un anticorps de lapin conjugué à la fluorescéine (marquage vert) ou à la rhodamine (marquage rouge ou rose) et dirigé contre les IgG de souris par exemple (si l'anticorps primaire est un anticorps de type IgG produit par la souris et dirigé contre une protéine du cytosquelette comme l'actine).  [...]

ubiquitine et protéasome

Le protéasome se situe au niveau cytosolique non Si ma protéine X d'intéret s'exprime au niveau nucléaire, et si je surexprime la protéine Y permettant d'apporter X à la voie de dégradation. est ce que je peux par un marquage spé de la protéine X montré sa dégradation par exemple si le marquage de X se déplace du compartiement nucléaire vers cytosol.  [...] pour tester l'hypothese que ta proteine d'interet est degradee par le proteasome, avant de se lancer dans la microscopie confocale ou manip de co-IP prot / ubiquitin qui necessitent de la mise au point, inhibe le proteasome par des inhibiteurs (ex. MG-132, ALLN,...) (manip qui marche bien et qui est simple).  [...]

[Immunologie] expression et phosphorylation de la protéine

Je souhaite avoir une explication pour le faite d'avoir un marquage de ma protéine sous sa forme phosphorylée en immunohistochimie alors qu'au niveau de son expression protéique le marquage est négatif sur la même tumeur. J'explique ça par le spécificité de l'anticorps mais est ce qu'il y d'autres explications.  [...] Les conditions d'hybridation. en WB la protéine est dénaturée, pas forcément en IHC. Certains anticorps ne fonctionnent qu'en IHC.  [...]

[Biologie Cellulaire] mise en évidence d'une phosphorylation

je travaille sur une protéine dont je voudrais mettre en évidence l'état phosphorylé. J'ai un faible marquage de cette protéine par un anticorps anti-phosphosérine/thréonine mais je voudrais m'assurer qu'il sagit bien d'un marquage spécifique. Pour celà, je regarde si ce signal disparait après traitement phosphatase (CIP ou lambda).  [...] Déjà, afin d'être sûre que la PKA ou la PKC phosphoryle la protéine in cellulo, vous pouvez transfecter des siRNA spécifiques de la PKA ou de la PKC et regarder si le marquage phosphosérine/phosphothréonine diminue voire n'apparait plus en western blot. La manip inverse peut aussi être une validation supplémentaire c'est à dire transfecter un plasmide surexprimant la PKA ou la PKC et regarder en western blot si le marquage par l'anticorps anti-phosphosérine/thréonine augmente.  [...]

anticorps monoclonaux anti CD3

Sans avoir de réponse précise, je pense que tu peux abandonner la première hypothèse. aucun interet de s'embeter à humaniser des anticorps pour ce type de manip'. On humanise des anticorps pour les utiliser en thérapie humaine (cf. cétuximab, panitumumab qui sont des anti-EGFR1 utilisés en thérapie anti-cancer) mais là juste pour un marquage c'est inutile.  [...] Les deux autres hypothèse sont possibles et relativement liées car même avec toute la volonté du monde on ne peut pas être sûr de la pureté de l'antigène produit. Ce qui veut dire qu'on ne peut pas être sur à 100% d'avoir un Ac monoclonal au final. Donc au bilan les réactions croisés de l'anticorps avec des molécule de structure épitopique proche sont possibles.  [...]

même marquage immunofluorescence dans le vert et le rouge

J'ai réalisé un double marquage immunofluorescent, protéine d'intérêt et protéine mitochondriale et le marquage sort exactement le même, dans un premier temps j'ai pensé que ma protéine se localisait exclusivement dans la mitochondrie. Mais voilà, en marquant la même protéine et une autre protéine non mitochondriale cette fois-ci, le marquage est complètement diffus et les deux marquages se superposent.  [...] . Donc je pense que cette fois-ci j'ai du pioché le mauvais aliquot. lapin anti-souris rouge qui va être reconnu par mon autre secondaire chèvre anti-lapin vert et donc donner le même marquage. Ceci m'amène à une autre question. mon secondaire chèvre anti-lapin vert n'aurait-il pas du reconnaitre mon anticorps primaire quand même ou est-ce que ça peut s'expliquer par l'affinité et la compétition entre les deux anticorps.  [...]