• Forum - Marquage, Anticorps, Protéines

[Immunologie] comment doser une proteine ?

-marquage par anticorps dirigés contre tes protéines, avec des anticorps contenant une séquence d'affinité ( affinity tag, je sais pas comment le dire en français).  [...] Lorsque des personnes trouvent la bonne volonté de te répondre, tache d'être courtois et respectueux envers eux, c'est la moindre des choses. Vu l'insolence dont tu as fait preuve envers Astrobax, et en guise d'avertissement, je ferme cette discussion.   [...]

[Biologie Cellulaire] Immunofluorescence

pour mettre en évidence la présence de NFKB dans le noyau par immunofluorescence indirecte, je dois fixer les cellules, les perméabiliser puis je les mets en présence d'anticorps anti NFKB (anticorps primaire), mais pour l'anticorps secondaire, je mets un anticorps qui s'exprime contre l'anticorps qui s'est fixé sur NFKBCet anticorps secondaire doit étre fluorescent,avec quelle molécule dois-je le coupler.  [...] L'anticorps secondaire pourra être un anticorps de lapin conjugué à la fluorescéine (marquage vert) ou à la rhodamine (marquage rouge ou rose) et dirigé contre les IgG de souris par exemple (si l'anticorps primaire est un anticorps de type IgG produit par la souris et dirigé contre une protéine du cytosquelette comme l'actine).  [...]

[Biologie Cellulaire] mise en évidence d'une phosphorylation

je travaille sur une protéine dont je voudrais mettre en évidence l'état phosphorylé. J'ai un faible marquage de cette protéine par un anticorps anti-phosphosérine/thréonine mais je voudrais m'assurer qu'il sagit bien d'un marquage spécifique. Pour celà, je regarde si ce signal disparait après traitement phosphatase (CIP ou lambda).  [...] Déjà, afin d'être sûre que la PKA ou la PKC phosphoryle la protéine in cellulo, vous pouvez transfecter des siRNA spécifiques de la PKA ou de la PKC et regarder si le marquage phosphosérine/phosphothréonine diminue voire n'apparait plus en western blot. La manip inverse peut aussi être une validation supplémentaire c'est à dire transfecter un plasmide surexprimant la PKA ou la PKC et regarder en western blot si le marquage par l'anticorps anti-phosphosérine/thréonine augmente.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème immunofluo

quelqu'un aurait de l'expérience en IF voici mon problème. j'ai jusqu'à présent travaillé avec des cellules vivantes en fusion GFP. Désormais je dois faire des IF sur cellules fixées. Pas de problèmes pour un marquage de la tubuline (avec des anticorps) ou pour un marquage actine (avec de la phalloidine), mais pas moyen d'avoir un signal avec ma protéine d'intérêt.  [...] L'anticorps marche bien en WB et la personne ayant précédemment travaillé dessus avait un signal qui semblait cracher à fond. J'ai suivi son protocole à la lettre mais pas moyen Pourrais-il y avoir un problème avec l'anticorps secondaire.  [...]

[Méthode d'étude] Immunochimie : Etape de contrôle.

En gros, chaque anticorps peut se fixer sur la cible attendue (c'est que l'on appelle un marquage spécifique) et/ou sur des cibles inattendues (c'est que l'on appelle un marquage aspécifique). En général, l'affinité de l'anticorps est largement supérieure pour sa cible (il est fait pour reconnaitre cette cible) que pour ses sites de fixation aspécifique.  [...] L'anticorps secondaire suit les mêmes règles. Il est conçu pour se fixer sur l'anticorps primaire mais peut se fixer aussi ailleurs. Un bon moyen de vérifier cela est d'incuber une préparation avec uniquement l'anticorps secondaire. On observe alors uniquement le marquage aspécifique.  [...]

Immunohisto

Enfin, il faut aussi mettre des contrôles positifs dans la manip (tissu ou l'on sait que l'on va avoir un marquage, lame avec un autre anticorps primaire, mais utilisant le même secondaire, pour éliminer un problème avec le substrat chromogénique,...).  [...] Comment expliquer que mon anticorps (spécifique de l'état phosphorylé d'une protéine) se fixe sur le tissu cérébral dans une structure Y (donc il marche.), mais pas dans la structure X (y a rien du tout de marquer.) où l'on observe du marquage en western avec le même anticorps.  [...]

[Journal club] Extinction de l'expression de gènes par les siRNA : la découverte

La figure concernée ne montre que le résultat obtenu avec le siRNA Lamine A/C où on voit une forte diminution du marquage cellulaire par l'anticorps anti-Lamine A/C sans affecter le marquage par l'anticorps anti-NuMa. Ce résultat est confirmé par western blot pour les lamines A et C.  [...] Pour ce qui est de mon cas. je travaille sur deux protéines ayant un fort pourcentage d'homologie puisque ce sont des isotypes. J'ai la chance d'avoir un isotype ubiquitaire et l'autre ayant un profil d'expression tissu-spécifique. Dans les types cellulaires sur lesquels je travaille pour le moment, je n'ai que l'isotype ubiquitaire qui est exprimé, donc que cette forme à éteindre, et je ne regarde pas si je croise avec d'autres protéines.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème marquage Actin par la Phalloidine

Je réalise marquage de ma protéine d'intérêt avec un anticorps primaire, puis un secondaire couplé au fluorophore.  [...] Ensuite je réalise un marquage de l'actin en utilisant de la phalloidin couplé à un fluorophore. Je ne parviens pas à obtenir un marquage correct de l'actin. Mon maitre de stage pense que je réalise trop de rinçage après la phalloidin (alors que c'est dans son protocole).  [...]

[Biochimie] Loaclisation cellulaire de proteines Pulse Chasse

[Biochimie] Loaclisation cellulaire de proteines Pulse Chasse.  [...] Le marquage doit être court afin de ne rendre radioactives que les protéines synthétisées pendant le pulse. Si le marquage était plus long, les protéines nouvellement synthétisées pendant le chase seraient également radioactives et cela ne permettrait pas de visualiser le transport des protéines au court du temps.  [...]

Banque d'expression et banque d'ADNc

Je voudrais poser une question qui va surement paraître un peu bête, mais je n'arrive pas vraiment à saisir la différence entre une banque d'expression et une banque d'ADNc… Toutes d'eux contiennent de l'ADNc, donc la différence c'est juste qu'on ne les utilise pas aux mêmes fins Mais si la banque d'ADNc contient de l'ADNc, alors elle pourrait aussi permettre la production de protéines… non.  [...] Bizarre, pourtant dans notre cours ces deux banques sont vraiment classées dans deux catégories différentes. En fait notre prof ne fait la différence qu'au niveau du criblage. elle dit que la banque d'expression ne peut être criblée que par des anticorps marqués (donc marquage de la protéine traduite) tandis que la banque d'ADNc peut être criblée comme l'ADNg par hybridation, ou bien comme la banque d'expression par AC… Mais pour moi ce qui est dit pour l'une est vraie pour l'autre aussi ^^'.  [...]