• Forum - Localisation, Protéines, Cellules

[Biologie Cellulaire] Immunofluorescence sur cellules surnageantes

En ce moment au labo, j'essaye d'obtenir une co-localisation de deux protéines par immunofluorescence dans des cellules leucémiques. Le problème est que le cytospin utilisé pour attacher les cellules sur une lame déforme les cellules. Le noyau a une forme correcte mais dans le cytoplasme, mes protéines ne localisent pas de manière précise comme c'est le cas pour des cellules adhérentes.  [...] Aussi, une publication d'une équipe anglaise attache ces cellules à la lamelle en déposant 30 µl de suspension cellulaire sur la lamelle puis en la faisant sécher à l'air, suivit de la fixation au PFA. C'est assez original. Cependant, dans tous les cas je ne trouve pas leur images prises au confocal très jolies, les localisations protéiques ressemblent plus à des amas flous qu'à des points bien focalisés.  [...]

[Biologie Moléculaire] Quelle stratégie adopter?

Pour se faire j'ai construis deux vecteurs, le  [...] contient un promoteur fort puis la PG1 et la GFP et le deuxième contient un promoteur fort puis la SIRT1 puis la luciférase je réalise un BRET en excitant la luciférase avec coelenterazine j'ai donc fluorescence de la GFP j'ai donc bien montré l'interaction or le professeur me demande de faire un test de localisation puis un test de fonction de la proteine endogène pour cela est ce que je dois prendre des cellules hépatiques non transfectées comme temoin pour la localisation il me semble qu'il serait judicieux de faire une immunohistochimie mais est ce que je detecte les 2 proteines dans la meme cellule et ceci avec 2 anticorps différents couplés avec une fluorescence différenteet pour la fonction je ne sais pas dutout d'autant plus qu'il faut savoir si la proteine chimerique modifie les fonctions endogènes de la proteine pour ca je netrouve pas de strategies.  [...] est ce que je dois prendre des cellules hépatiques non transfectées comme temoin pour la localisation il me semble qu'il serait judicieux de faire une immunohistochimie mais est ce que je detecte les 2 proteines dans la meme cellule et ceci avec 2 anticorps différents couplés avec une fluorescence différente.  [...]

[Biochimie] Question sur les protéines...

Des protéines chimériques, on sait faire aussi. Pour info, le prix nobel 2008 de chimie a été donné aux chercheurs qui ont découvert la GFP, une protéine fluorescente que l'on greffe très souvent à d'autres protéines afin d'étudier par exemple leur localisation cellulaire.  [...] Tu dois bien connaître quelques protéines et leurs rôles respectifs. Commence déjà par nous donner tes idées d'organisation du devoir, on ne le fera pas à ta place.  [...]

[Biologie Cellulaire] Réticulum Endoplasmique

Le reticulum endoplasmique Granuleux se trouve à la face cis de l'appareil de golgi, mais la localisation exacte est assez variable et dépend des types cellulaires. (Déjà correspond aux cellules qui produisent des protéines.) Par exemple au niveau de la cellule pancréatique exocrine il se retrouve fortement au pôle basale.  [...] Autour du noyau dans les cellules non polarisées (mieux vaut aller au plus simple plutôt que pomper quasi mot pour mot wikipédia parfois).  [...]

[Biologie Cellulaire] extraction protéique (ERK1/2) à partir de cellules U2OS

je suis un nouveau dans ce forum, j'ai un soucis, je voulais faire des culots cellulalires à partir des boites 35mm de cellules transfectées, la derniere fois javais pas beaucoup de prot en dosage lowri sachant bien que je gratte ma boite de cellules dans du PBS et je centrifuge 1000 RP 2min, après je lyse mes cellules dans du leamli 2X et je l'ai dose et ce que kelk'un pourrait me donner un protocol.  [...] Ok je m'explique. les cellules sont des cellules U2OS osteosarcoma cells, la prot est une phosphoerk ERK1/ERK2, mais je détecte aussi des prot cytoplasmiques, merci pour la réponse c urgent.  [...]

La microscopie à 2 photons et le mouvement des proteines

Ou les auteurs visualisent sans fixation le mouvement d'une protéine cytoplasmique en temps reel, grace a deux techniques de microscopie. Le FRAP et microscopie à 2 photons.  [...] La protéine est alors pistée dans les cellules. sa localisation spatio-temporelle peut être déterminée avec précision (à 10 millisecondes et à 1 micron près).  [...]

[Biologie Moléculaire] Molecules marquées

La GFP est la molécule fluorescente en elle-même, elle n'est pas marquée elle sert au marquage, on l'utilise souvent couplée à des protéines pour visualiser leur localisation celluliare grâce à la fluorescence émise par la GFP.  [...] J'avais connaissance aussi de l'aéquorine provenant de la méduse, elle n'émet pas de la fluorescence mais de la luminescence, c'est une photoprotéine naturelle, mais c'est le même principe, elle peut être utilisée comme sonde pour marquer d'autres molécules.  [...]

[Biochimie] Prediction de structure dume proteine native et sa forme mutee

La N-myristoylation intervient le plus souvent dans l'ancrage de protéines aux membranes, donc cela peut modifier la localisation cellulaire de la protéine en question. Elle peut aussi impacter la stabilité de la protéine et donc sa demi-vie.  [...] Le myristoyl peut parfois être impliqué dans des interfaces protéines-proteines. Son absence peut donc faire disparaitre ce type d'interaction.  [...]

[Biologie Cellulaire] voies de signalisation et localisation subcellulaire

Je voulais savoir si vous connaissiez des voies de signalisation intracellulaires impliquées dans la localisation subcellulaire de protéines (ex. localisation à un pôle précis de la cellule, au niveau de certains organites (mitochondrie, RE), périnucléaire ou nucléaire en dehors des cas de protéines portant une séquence NLS).  [...] ça serait pour avoir des pistes de manips pour décrypter les déterminants de la localisation en dehors du cytosquelette (au cas où j'aurais une question sur ce sujet lors de mon oral).  [...]

l'Actine, ses homologues et l'origine de la polarité

Savez-vous si l'actine chez les eucaryotes est capable d'entraîner une polarité dans la localisation de certaines protéines pouvant ainsi mener à une division asymétrique De ce fait, l'actine pourrait elle êre un argument pour dire que l'une des origines de la différenciation réside chez les procaryotes.  [...] Oui on connait des mécanismes de division asymétrique notamment chez une protéobactérie C.crescentus. Si on déplète en actine cette cellule, on observe une perte de la forme, mais aussi de la localisation à un pôle de certaines protéines, impliquées dans la formation notamment des pili ou d'un pied d'adhésion.  [...]