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[Biologie Moléculaire] Expression de protéines grâce au pGEX. DH5alpha ou BL21?

Perso, OUI j'utilise toujours la proteine parfaite. Pour la simple et bonne raison que si elle ne l'est pas, tu pourras toujours te faire attaquer sur le fait que ta conclusion est peut etre due a la mutation.  [...] Je n'ai jamais produit de proteine de fusion. J'avais besoin d'une construction et au lieu de recevoir un simple plasmide, j'ai recu une construction dans un pGEX. Je suppose que c'est pour produire ma prot en fusion avec les GST.  [...]

Méthode de marquage - HaloTag

Si j'ai bien compris la brochure, en gros au lieu d'avoir une GFP comme protéine de fusion, c'est le Halo tag qui est couplé à la protéine d'intérêt. Le principe a l'air assez simple, en gros on peut ensuite coupler n'importe quoi sur le Halo (billes, biotine, fluorophore.  [...] ..). Ce qui fait qu'on peut l'utiliser pour localiser la protéines d'intérêt dans un tissu ou une cellule avec la fluo, mais aussi coupler avec des billes pour faire un réaction biochimique, ou encore fixer la protéine sur une lame de verre, le tout sans devoir recommencer le clonage à chaque nouvelle application.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protéine de fusion

Pour réaliser une protéine de fusion, la plupart du temps on ligue une séquence de restriction en 3' de l'ADNc codant la protéine N-terminal et la même séquence de restriction en 5' de l'ADNc codant la protéine C-terminale. On choisi une séquence qui une fois clivée génère des bouts collants.  [...] Pour faire une protéine de fusion AB, il te suffit simplement de mettre la séquence codante de B juste à la suite de celle de A. Il faut juste enlever le codon stop à la fin de la séquence de A (sinon tu ne produiras que la protéine A). Tu vas alors obtenir un seul ARNm qui sera traduit en protéine AB.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pull down GST

Je souhaite donc fixer ma protéine en fusion en GST sur une colonne pui ensuite faire passer mes différents extraits cellulaires afin de déterminer des éventuels partenaires de ma protéine.  [...] Personnellement j'utilisais environ 10-15µg de proteine de fusion GST (80kDa au total) couplées aux billes GST pour faire mes test d'intéractions.  [...]

[Biologie Moléculaire] Disparition inexplicable

J'utilise une protéine transgénique qui est en fusion avec le marqueur GFP. Grâce à la fluorescence il m'est possible de suivre l'expression de ma protéine dans le sang des animaux. Mais voilà que la fluorescence a subitement disparue de tous les animaux, alors que la protéine transgénique continue de s'exprimer.  [...] Tu pourrais donc voir si l'acidification de tes cellules qui expriment encore ta proteine de fusion a les memes consequences. Quand tu aurra trouvé vraiment à quoi c'est du, je serai curieux de le savoir.  [...]

Protéine de fusion recombinante dimérique, besoin d'aide.

- Pour faire une protéine dimérique, comment on peut opérer Je pensais qu'on pouvait par exemple prendre deux plasmides et ajouter à la fin des deux gènes d'intérêt la thioredoxine.  [...] Pour une protéine de fusion, les deux séquences codantes sont mises à la suite l'une de l'autre sans codon stop entre les deux. une seule chaîne est produite.  [...]

Phage display et banque d'ADNc

Le principe c'est de faire exprimer la protéine à la surface du bactériophage et puis d'isoler les bactériophages qui expriment la protéine d'intérêt à l'aide d'Ac (et pour réaliser ca, on fait des protéines de fusion).  [...] Donc on a des milliers de phages avec chacun une protéine de surface différente (correspondant à la fusion de l'ADNc porté avec la protéine de surface).  [...]

Quel fluorochrome combiner avec rsCherryRev?

J'aimerais faire une protéine fusion avec 2 fluorochromes différents, l'un doit être photoréversible pour une expérience de SMPB répétée et l'un toujours activé, c'est donc une protéine fusion.  [...] Je pensais que pur travailler dans le vivant une protéine de fusion était presque obligatoire mais encore une fois mes connaissances dans ce domaine sont limitées.  [...]

Technique

dans le GST, il faut un tag GST, donc une protéine de fusion. Dans l'IP, pas besoin de protéine de fusion, on peut le faire sur une protéine native, mais il faut un anticorps spécifique.  [...] Tu peux donner des avantages et inconvénients de l'utilisation de méthode par rapport à une autre dans le cadre d'une question biologique ou d'un problème précis à résoudre que tu te poses, mais en donner de manière générale je ne vois pas vraiment.   [...]

[Biochimie] Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

On veut donc fabriquer cette proteine de fusion qui est composé de deux domaines correspondant chacun a l'une des deux proteines d'interet et reliés entre eux par une liaison peptidique. Si elle se replie bien alors la proteine exprimera les deux propriétés (cool ).  [...] Ca dépend. Vu que tu fais une protéine de fusion, tu ne peux exclure que le domaine GFP ne gêne la protéine d'intérêt (par encombrement par exemple). Dans ce cas tu peux essayer les deux types de construction, voire insérer un linker entre les deux domaines afin de les espacer un peu.  [...]