• Forum - Lait, Anticorps, Membrane

[Divers] Contenu "Matériels et méthodes" - rapport stage M1

Après transfert, la membrane est bloquée dans une solution de lait 5% TBS-Tween 0,2% pendant 1 heure à température ambiante sous agitation. Elle est ensuite incubée avec les anticorps primaires anti-BRCA1 monoclonal (D9) dilué au 1/500 (Sigma®), anti-HSP60 monoclonal (CK) au 1/1000 (Sigma®) pendant une nuit à 4°C sur une plaque rotative.  [...] Après 3 lavages dans du TBS-Tween 0,2%, la membrane est incubée pendant 1 heure en présence de l'anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à l'HRP (Horse Radish Peroxidase, Cell Signaling) dilué au 1/5000 dans du lait 5% TBS-Tween 0,2% sous agitation.  [...]

[Biochimie] Western blot incubation Ac I sous sachet scellé

La solution de TBS-T lait avec anticorps primaire bouge rarement de façon visible dans la poche d'incubation. Pourtant à une échelle inférieure, invisible, il y a bien un mouvement suffisant pour avoir un marquage homogène. Le fait que vous ayez un signal fort provient soit d'une trop forte concentration en anticorps primaire, soit une concentration trop forte en anticorps secondaire, soit d'un temps d'exposition trop long.  [...] Quelques toutes petites bulles pourquoi pas, mais il faut absolument éviter les grosses bulles qui viendraient se plaquer sur la membrane, ou rendre le contact avec le lait + Anticorps inhomogène sur la membrane.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expliquer le Blocking buffer

en immunohisto, je ne sais pas. Par contre, en western blot, on utilise un blocking buffer pour saturer la membrane. Ce buffer est souvent du lait ou de la BSA ou une sauce commerciale... Le principe est qu'il contient des protéines. Les anticorps étant eux même des protéines, ils pourraient se fixer non spécifiquement sur la membrane et faire du bruit de fond lors de la révélation.  [...] En saturant la membrane avec des protéines non spécifiques, il y a moins d'AC qui va s'y fixer car les interactions protéine/membrane non spécifiques doivent être plus fréquentes que les interactions protéine/protéine non spécifiques.  [...]

[Biochimie] Western blot

L'incubation de la membrane de nitrocellulose avec le methanol est important avant le transfert même si aujourd'hui on à des membranes d'assez bonnes qualité.  [...] Tampon de saturation. attention, ne JAMAIS utiliser de lait pour saturer des membranes qui seront incubées avec des anticorps anti-phosphotyrosine. Le lait contient des phosphatases, alors tu vas perdre ton signal. Sinon, comme le dit Yoyo, il n'y a pas de protocole idéal.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot sur des echantillons de foie murins - Page 2

Pour pAkt, il faut essayer différentes conditions de blocage, notamment BSA et lait, et aussi changer le milieu d'incubation de l'anticorps (lait ou BSA également).  [...] Pour le pIR, si ça ne marche pas bien il faut envisager de faire des WB a partir d'échantillons immunoprécipités avec l'anticorps IR.  [...]

[Biochimie] bandes parasites aprés révélation western-blot

mon éluat final d'IP contient l'Ac que j'ai utilisé pour réaliser mon IP et bien sur ma protéine d'intérêt, je réalise ensuite un SDSpage et un western sur la nuit, je révèle mon blot à l'aide de l'Ac que j'ai utilisé pour mon IP ainsi qu'avec un Ac-HRP dirigé contre mon Ac d'IP, je bloque la membrane avec lait écrémé 3%.  [...] apré révélation du blot à l'opti 4CN (biorad) je retrouve bien ma protéine d'intérêt (IP fonctionne) ainsi que la bande haute et basse de mon Ac spécifique de ma protéine, mais si je laisse le blot révélé plus longtemps, je vois apparaitre d'autres bandes autour de celles de l'Ac (révélation du blot ~2min) ces bandes sont elles dû à un mauvais blocage de la membrane utilisation d'un Ac-HRP polyclonal comme Ac secondaire.  [...]

[Biologie Cellulaire] Western Blot ATM phosphorylé

La protéine apparait autour de 100kDa au lieu de 370kDa. Je voulais savoir si quelqu'un avait déjà ce problème avec cet anticorps.  [...] Là en revanche c'est beaucoup trop. D'une part, ca doit migrer n'importe comment dans vos gels, et d'autre part ca doit géner la reconnaissance des anticorps. Parfois moins est mieux que plus. Diminuez, même drastiquement. Essayez 10µg, 20µg, 40µg. Vous aurez peut être des surprises.  [...]

[Biologie Cellulaire] Immunocytolocalisation - Anticorps primaire 3-4h ?

Pour avoir fait pas mal d'immuno-Histo et immuno-cytologie, je te conseillerai pour ma part de faire 1H d'anticorps primaire (LARGEMENT suffisant) et 1H de secondaire si besoin.  [...] En tout cas, je vous confirme bien que cela fonctionne. Comme je n'avais pas encore lu les dernières réponses, j'ai fait 30 min de fixation, blocage au lait 10% pdt 1h, 3h d'anticorps primaire et 1h d'anticorps secondaire.  [...]

[Physiologie] le prion

les nouveaux nés sont protégés pendant 6 mois par les anticorps du lait maternel. Les anticorps sont eux aussi des protéines, et là aussi ils sont absorbés par le tube digestif sans subir la dégradation des protéines.  [...] Ainsi, une mémoire de défense contre cet agent pathogène se crée et si l'on est un jour en présence de cet agent, le corps sait se défendre et met tout en oeuvre pour l'éliminer rapidement, avant qu'il ne soit répliqué en trop grand nombre dans notre corps.   [...]

Ultrafiltration du lait

J'ai réalisé l'ultrafiltration du lait. je sais que dans mon lait j'ai des protéines, des glucides, des lipides et des minéraux et que la masse molaire de la plus petite molécule retenue par la membrane est de 300 KD (seuil de coupure).  [...] Quelles sont celles qui seront arrêtées par la membrane.  [...]