• Forum - Kit, Rendement, ARN

[Biologie Moléculaire] Extraction ARN

j'ai testé plusieurs protocole d'extraction d'ARN (kit RNeasy, Chang et Al 1993, Reid et Al 2006) mais je n'obtiens pas un grand rendement (200ng/uL et en faisant 8 répliquat par échantillons j'obtiens au mieux 10ug...) Il m'en faudrais bien plus car après je dois synthétiser des cDNA et là il me faut 100 ng minimum d'ARNm.  [...] Au début du protocole de chang et Al, on doit incuber 10-15 min à 65°C, peut etre faut -il incuber plus longtemps, 30-45min (je reste sur ce protocole car kit presque épuisé, et protocole de la vigne= Reid et Al =contamination ADN avec un traitement à la DNAse...).  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction d'ARN

D'après ce tableau, le kit RNeasy Micro que tu t'apprête à utiliser convient uniquement aux petits échantillons de cellules ou de tissus. J'ai bien peur que ton kit Picopure RNA Isolation de chez Arcturus soit également optimisé pour les tissus animaux.  [...] On utilise le kit qiagen quantitect et nous en sommes très content. On peut travailler avec de faibles quantités de materiel au départ (1µg d'ARN mais voir la suite), le rendement est plus que bon. Trop bon même étant donné que si le protocole invite à une dilution finale dans 20µl nous diluons toujours immédiatement dans 200µl et ensuite on ajuste.  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction ARN

Je suis entrain d'optimiser une extraction d'ARN chez le chêne Liège. J'ai essayé un kit commercialisé mais la pureté et le rendement en ARN est très faible. J'ai trouvé ds un article un kit maison, il utilise du glycogene pour précipiter l'ARN. Est ce que qlq'1 connaît un autre produit pour substituer le glycogene.  [...] J'utilise normalement soit trizol ou des kits commercialisés mais c'était pour des plantes herbacées. C la première fois que je travaille sur le chêne.. J'ai fait une première extraction avec un kit auquel j'ai ajouté au début du PVP mais j'ai eu un rendement très faible avec un ratio 280/260 et 230/260 a peine 1.4.  [...]

[Biologie Moléculaire] extraction d'ARN

J'ai juste remarqué qu'en travaillant sur des échantillons congelés dans le TRIzol, j'avais un meilleur rendement que si je les traitais de suite après le prélèvement. Le fait de chauffer les échantillons pour favoriser la dissolution des sels avant extraction augmenterai mon extraction d'ARN.  [...] Juste pour vous dire que j'ai retenté une extraction d'ARN en faisant un lavage supplémentaire au chloroforme et mon rapport DO 260/230 est passé de 0,4 à 1 donc nette amélioration. J'ai dû cependant compenser la perte de rendement d'ARN en partant d'une quantité d'échantillon de 30% supérieure.  [...]

[Biochimie] problèmes avec ARN long et structuré

Je viens de commencer en thèse et j'ai besoin de conseils relatifs à la synthèse et au marquage radioactif d'un ARN. Je suis confrontée à deux types de problèmes. le premier, j'ai un très faible rendement lorsque je transcrit cet ARN (0,6 ou 0,8µl/µg max).  [...] Je dois préciser que cet ARN est tres long et très structuré. 514 nucléotides et 14 tiges boucles.. Je le purifie sur gel acryl/bisacryl 5% après transcription. J'ai lu plusieurs fois que pour de si longs ARN, une purification sur colonne HPLC était mieux niveau rendement, par contre, il n'est pas vraiment possible de séparer les produits de transcription abortive ou les dégradations.. Qu'en pensez vous.  [...]

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

Seulement, je me retrouve en compétition entre ma K7 de résistance et mon insert + des vecteurs non digérés. Comme il s'agit d'un phagemid, celui produira des phages et la présence de phage wt entrainera une plus grande infectiosité des phages wt vis a vis des phages clonés. Je me retrouverais à terme avec que des wt.   [...] As-tu déjà essayé de purifier ton ADN avec un kit de purification de produits de PCR J'avais commencé mes clonages avec un kit de purification sur gel. Le problème est que le rendement de ce genre de kit est souvent faible. Cela occasionne une grosse perte de matériel, surtout au bout de 3 ou 4 purif.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème quantité d'adn plasmidique après extraction

L'ARN est sûrement la source du problème. Par contre, quand tu dis que tu as effectué un gel pour vérifier les quantités et que tout était OK, est-ce que tu veux dire que tu semblais avoir du 2 µg/µl De toute manière, c'est évidement possible. Suffit de resuspendre dans un volume assez faible.  [...] Si tu ne veux vraiment pas utiliser de kit (c'est quoi ton probleme avec el kit le rendement tu peux l'augmenter par une phase d'amplification au chloramphenicol), alors il faut faire une purification sur gradient de cesium. mais c'est super chiant.  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction ADN sur lame de paraffine

Je suis à la recherche d'infos pour optimiser mon extraction ADN à partir de lame tumorale incluse en paraffine. j'utilise un kit Qiagen. J'ai peu de tissu donc un rendement très faible ADN. 10 ug/ml. Ensuite la PCR de mon gène cible ne donne rien. Avez vous des trucs et astuce depuis le moment ou j'extrait de la lame jusqu'au moment ou j'élue pour augmenter ma quantité d'ADN purifié finale.  [...] Je ne connais pas ce kit mais il y a possibilité (si ce sont des colonnes) d'augmenter soit le rendement, soit la concentration en modifiant le volume d'élution, en faisant 2 élutions successives ou en utilisant du TE ou de l'eau a 40°.  [...]

[Biotechnologie] Comment déterminer le rendement d'une RT?

La seule methode pour determiner un rendement de RT est de rajouter un ARN de synthese pur et de quantitee connue. Si tu sais combien tu met de cet ARN au depart, tu va le traiter comme les autres lors de la RT et lors de ta PCR tu va quantifier ton ADNc provenant de cet ARN en meme temps que tes echantillons.  [...] Deuxièmement, puisque on fait ADNc/ARN après la PCR qui nous dis que la PCR à été efficace à 100% pour ne pas biaiser la quantification du rendement de la RT.  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction d'ARN de plantes

Le but derrière tout ça serait d'avoir un rendement plus élevé qu'avec les kits utilisés jusque là (RNeasy Plant Mini Kit de Qiagen).  [...] Je te conseille systématiquement de passer par des kit adaptés aux plantes ou des protocoles modifiés. Tu peux risquer bien entendu mais le problème est que la concentration en sucre des échantillons est très importante et parasite les réactions, généralement c'est la cause de mauvais rendements.  [...]