• Forum - IP, Mort, Cellules

[Biologie Cellulaire] pseudo synchronisation des cellules sans faire exprès

Oui un conttrôle où seul l'alexa fluor 488 (censée intéragir avec l'EdU) est incubé. Ces cellules sont marquées à 0%, c'est vraiment un test très spécifique. On m'a dit que les cellules en forte proliération pouvaient atteindre 30% dans un pulse de 30 min de traitement à l'EdU.  [...] Pour faire une analyse du cycle cellulaire en FACS, tu fixes tes cellules, tu les perméabilises puis tu les colores à l'IP. Vu qu'elles sont perméabilisées, l'IP entre dans toutes les cellules, à la différence d'un test apoptose Annexin V / IP où on ne perméabilises pas les cellules exprès pour pouvoir discriminer les différents types de mort cellulaire (nécrose = IP+).  [...]

[Biologie Cellulaire] Marquage à l'iodure de propidium pour suivi du cycle cellulaire

Non c'est tout à fait normal que deux résultats de mort cellulaire obtenus avec deux méthodes différentes ne donnent pas les mêmes proportions de mort. Je ne connais pas la méthode de TMRM. En revanche j'ai déjà fait bleu trypan et marquage IP en parallèle et je peux t'assurer qu'en bleu trypan le pourcentage de mort était de l'ordre de 60% alors qu'en marquage IP la fraction de cellules en subG1 était de 15-20%.  [...] Pour le marquage IP, comme tu l'as dit, les cellules en subG1 le sont surtout à cause d'une fuite des fragments d'ADN clivés hors de la cellule. Seulement, le clivage régulier de l'ADN internucléosomal est typique d'un processus apoptotique. Dans le cas des autres morts cellulaires, la dégradation de l'ADN peut intervenir plus tardivement dans le cas d'une mort cellulaire par autophagie et/ou est plus anarchique comme dans le cas d'une nécrose.  [...]

Visualisation d'une cellule apoptotique....

Sinon il y a bien un substrat fluorescent de caspase, mais il faut certainement perméabiliser aussi. On a aussi pensé à l'Anexine 5 mais il me semble que ça ne va pas faire la distinction entre les cellules nécrotiques et les cellules apoptotiques (puisqu'il y a du FLIP-FLOP des phosphatidyl serine, dans les 2 cas = la membrane est fragilisée dans les 2 cas.).  [...] En fait, pour l'instant je les met en apoptose et je regarde les changements morphologiques de mes cellules et c'est clair qu'elles sont apoptotiques. Pour l'instant je fais ça sans marqueur pour voir si ça marche et pour tester mes doses de staurosporine.  [...]

[Biochimie] Cytométrie en flux !

avec un seul marqeur tu peut soit marquer les cellules vivantes, et déduire du total d'évènement soit marquer les cellules mortes, avec par exemple de l'iodure de propidium, et dans ce cas là tu ne vois que les cellules mortes (apoptose et nécrose pour l'IP).  [...] avec 2 marqueurs tu peux en choisir un spécifique des cellules vivante et l'autre des cellules mortes ou un spécifique des cellules apoptotiques et l'autre des cellules en nécrose.  [...]

[Biologie Cellulaire] Cycle cellulaire

j'ai trouvé une difficulté dans la comprehension de principe du FACS et surtout comment ce fait le tri cellulaire et dans l'interpretation de l'histogramme (facs). nombre de cellules = F(quantt d'ADN). aidez moi svp.  [...] Greg quand tu dis que l'IP rentre dans les cellules nécrotiques car la membrane est permeable car lésée, l'IP peut donc servir à caractériser l'apoptose à un stade avancé, par rapport à un début d'apoptose.  [...]

[Biologie Cellulaire] marquage et apoptose

lors de l'apoptose, l'annexin est exposéé à la surface des membranes. De plus les cellules laissent alors entrer l'IP, tu as donc un double marquage.  [...] Lors de la nécrose, il me semble que seul le marquage IP est présent, ce qui permet de distinguer ces deux types de mort (à confirmer cependant, ce sont de lointains souvenirs).  [...]

[Biologie Moléculaire] Marqueur spéficique apoptose

J'ai testé une molécule sur les cellules en apoptose et en nécrose. Elle marque les deux mort cellulaires. On m'a dit que le fait qu'elle ne soit pas spécifique de l'apoptose était un inconvénient. Mais est-il possible qu'une molécule soit spécifique de l'apoptose et donc qu'elle ne marque pas les cellules nécrotiques Si oui, comment est-ce possible.  [...] Je travaille sur une forme de mort cellulaire non apoptotique et je confirme que pour distinguer les cellules apoptotiques, des cellules nécrotiques, je fait un marquage annexin V/PI.  [...]

[Biologie Moléculaire] Immunoprécipitation

Quelle est la quantité de cellules que vous lysez Quelle volume a votre fraction insoluble chromatinienne et combien déposez vous sur votre WB.  [...] Je fais mes IP sur 1,5mg par échantillon (ma protéine n'étant pas trés abondante) donc environ 7 millions de celllules par puit lors du WB. Cela dit après avoir lysé mes cellules (tampon salin ou NP-40 pendant 30 min) je centrifuge le lysat et ne fait mon IP que sur le surnageant.  [...]

[Biologie Cellulaire] Iodure de propidium

J'utilise l'IP liquide, je récupère les cellules, puis le lavage dans le PBS, une resuspension des cellules dans 100µl d'iodure de propidium (5µg iodure de propidium(Sigma) dans un tampon citrate), puis dans 200 µl de tampon citrate (3,4 mM de citrate de sodium, 0,1% TRITON/PBS). C'est pour analyser le cycle cellulaire.  [...] L'IP marche bien et très facile pour voir s'il y a de l'apoptose, mais il faut bien choisir le nombre de cellules au départ, c'est en fonction du type et de la nature des cellules, si elles poussent trop vite ou non.  [...]

[Biologie Cellulaire] apoptose cytométrie

pour les cellules adhérentes on préfère utiliser le DiOC6 couplé avec de l`IP. Il y a souvent du bruit de fond avec l`annexine après le traitement pour récupérer les cellules adhérentes.  [...] Je n'avais pas eu l'idée de récupérer le surnageant en effet les cellules apoptotiques perdent de l'adhérence par conséquent il est important de le faire.  [...]