• Forum - Intensité, Bande, Quantité, Protéine

[Biologie Moléculaire] Biochimie: méthode de Western Blot

En fait, doser les protéines avant un Western blot permet de déposer la même quantité de protéines dans chaque et pour chaque échantillon.  [...] Ainsi, si tu as deux échantillons identiques, mais que tu déposes deux quantités différentes de protéines, les deux bandes auront une intensité différente. Ce qui peut fausser les conclusions (genre. mon echantillon 1 a plus de protéines que le 2, donc le 2 produit plus efficacement).  [...]

[Biochimie] Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

La différence d'exposition permet de voir si de nouvelles bandes apparaissent. Par exemple, tu peux voir sur le temps d'exposition long des bandes qui sont invisibles sur le temps d'exposition court (car la quantité de protéines correspondant a cette bande est faible, voir figure 4 gel E).  [...] Les bandes d'actine ont un rôle de témoin. Par exemple, pour pouvoir comparer les deux conditions dans le gel A il faut que les deux bandes d'actine est la même intensité (ce qui veut dire que les quantités de protéines sont a peu près égales entre les deux conditions).  [...]

Problème de migration SDS-PAGE

Je dépose donc ma fraction totale (2uL de protéine stock + 18uL de Laemmli Buffer 5X), ma fraction soluble concentré qui est resuspendu dans du Laemmli Buffer 5X, et mon culot.  [...] Je fais migrer mes fractions sur un gel SDS-PAGE 15%, la migration ne migre pas droite par rappport à mon marqueur de taille, j'ai des trop grosse bande (non du à la quantité de protéine déposée) qui déborde c'est assez bizzarre auriez-vous une solution à mon soucis.  [...]

[Biotechnologie] quantification des protéines

ils ont fait une electrophorese en 2D, ensuite ils ont autoradiographié le gel, ensuite ils disent qu'ils ont excisé les spots et qu'ils ont fait une scintillation liquide puis denombrement. d'autre part, ils disent qu'ils ont excisé d'autres spots et qu'ils ont analysé les acides aminés.   [...] L'autoradiographie permet de reveler les spots sur le gel 2D. Ils decoupent les spot et ils font une scintillation liquide pour quantifier (la radiactivite est proportionelle a la quantite de proteine), puis ils envoient la bande en MS ou edman pour avoir la sequence en AA.  [...]

[Biologie Cellulaire] ultracentrifugation et cellules!

je voudrais réaliser des ultracentrifugations différentielles afin de déterminer la localisation d'une protéine spécifique qui m'intéresse. mais au lieu de le faire sur tissu, j'aimerais le faire à partir de culture de HEK. Auriez vous une idée du nombre de cellules dont j'ai besoin pour avoir au final une quantité de proteine suffisante pour faire des western.  [...] Tout dépend du compartiment cellulaire que tu veux isoler, de la représentation de ta protéine dans ce compartiment...Donc c'est par l'expérience que tu sauras quelle quantité de cellule te permet d'avoir une bande convenable en western. Pour commencer tu peux essayer plusieurs conditions où tu auras mis un nombre croissant de cellules.  [...]

Gel Shift : problème avec la compétition

J'ai fait plusieurs gels et j'obseve un shift avec ma protéine, en fait j'ai testé 4 quantités différentes de prot et quand j'augmente la quantité j'obtient un retard plus important.  [...] Par contre lorsque j'ai réalisé une compétition avec ma sonde froide, avec un excès deX10 j'ai tjs un shift (qui tend à migrer moins loin que le shift sans compétiteur) et avec un excès de X35, j'obtient un shift plus important que sans le compétiteur et qu'avec la quantité X10, avec une intensité de ma bande plus grande.  [...]

[Biologie Moléculaire] Purification Protéines Tag 6His

2) J'ai fait un suivi de la protéine en prenant des aliquots à chaque étape de purif. Je retrouve ma protéine dans le surnageant, des traces minimes dans les lavages et elle est à la bonne taille. En revanche la fraction purifiée (éluat) donne une bande légèrement en dessous des autres.  [...] N'aurais tu pas une modification post traductionnelle de ta protéine ou un clivage d'une region leader par expl Car il est peu probable que ta protéine courte existe dans ton eluat vu les différences d'intensité des bandes et que la bande de bas poid n'est pas du tout visible, alors qu'elle represente quasiement toute les proteines apres élution.  [...]

[Biochimie] Concentration d'un produit PCR

On peut avoir une concentration à partir de la bande du produit PCR uhuh dire qu'on m'a toujours répété que la PCR n'était pas quantitative... Je pense que ça doit être loin d'être précis la lecture de l'intensité de la bande... le BET ne se fixe pas de la même façon sur tous les produits.  [...] Oui on peut doser à partir d'un gel d'électrophorèse, en faisant des comparaisons de fluorescence (en gros on sélectionne une bande témoin ou on lui dit il y a tant et il peut estimer la quantité d'ADN dans notre bande). Après c'est un jeu. il faut bien sélectionner sa bande, avoir un gel propre, etc... Et la précision n'est pas super.  [...]

[Biologie Moléculaire] Causes d'échecs de la production de protéines recombinantes

Quand tu veux vérifier que tu exprimes bien ta protéine, la première chose que tu fais c'est un gel (SDS-PAGE). Si elle est bien produite, tu va observer une belle bande en bleu de Coomassie. Mais bien sûr comme contrôle tu dois aussi déposer sur ton gel du lysat de cellules prélevées dans la culture avant d'ajouter l'inducteur.  [...] ) car au bout d'un certain temps on n'observe plus d'augmentation de la production. Et au bout d'un long moment on observe même une diminution de l'intensité de la bande car la protéine est dégradée. Il faut donc trouver l'équilibre pour avoir une bonne production sans qu'il y ait protéolyse.  [...]

Saturation BSA pour purif de protéine His-tagged

Or il s'avère que lors de nos purifs, nous obtenons certes la protéine P couplée à H (=His) (donc rien d'anormal) mais également une grosse quantité de protéine P seule sans l'autre protéine couplée à l'histidine (la taille de la bande le confirme), ce qui n'est pas normal (bien que l'on surexprime P et H).  [...] Non mais je pense que je me suis mal exprimé... Je retrouv ebien la liaison là où je dois l'avoir donc pas de problème à ce niveau là. Mon souçis vient du fait que là où je ne peux pas avoir d'interaction avec une protéine His taggée (vu que je ne l'ai pas transfectée et qu'elle n'est pas assez présente dans la cellule à l'état endogène), je descend quand même ma protéine non liée à une 6His.  [...]