• Forum - Idée, échantillons, Western

[Biologie Moléculaire] mes échantillons avec le laemmli se transforment en gel !

Pour un western blot je prépare mes échantillons (des surnageants de cellules pour une production de protéine recombinante) dans du laemmli (Tris, SDS, glycérol, bromophenol blue, ß-mercaptoethanol). Jusque là tous va bien, mais après l'étape à 95°C je me retrouve avec une sorte de gel compact dans mon tube.  [...] Avez vous une idée de la cause ou avez vous un autre moyen de déposer des échantillons pour un western blot.  [...]

[Biochimie] élution protéine

Soit tu fais un western blot avec un anticorps dirigé contre ta protéine d'intérêt. Cela ne te permettra pas de tirer une conclusion définitive mais d'avoir une idée sur la nature des pics. Pour avoir une conclusion quasi-définitive, tu analyses tes échantillons par spectrométrie de masse (ESI-MS douce pour une indication de masse, MS-MS pour une définition de la séquence peptidique).  [...] Est-ce que vous êtes tous partis du même produit pour la purification sur chromato ou avez-vous préparé chacun vos échantillons à purifier.  [...]

problème de western blot

j'ai depuis peu un problème dans mes western blot, mes échantillons (protéines extraites de culots cellulaires) migrent en vague alors que mon poids moléculaire est normal. Rien n'a changé par rapport à d'habitude à part les échantillons eux mêmes.  [...] Au moins tu as appris une belle leçon, refaire toutes les solutions quand quelque chose ne fonctionne pas... et surtout ne pas chercher à savoir pourquoi soudainement ça ne marche plus... c'est souvent une perte de temps.   [...]

[Divers] Probleme western blot!!

Pas de différence entre les échantillons. ce sont differents mutants mais précedemment lors d'autres extractions et western ils migraient très bien.  [...] La c'était 75ug mais ca me le fait a 50 et 100ug de proteines. les échantillons n'ont pas était chauffé. Ils ont juste était préparé le jour précédent le western (lammly buffer ajouté) et congelé, gel préparé également le jour d'avant (mis au frigo dans su tampon d'éléctrophorèse).  [...]

[Biochimie] Phosphorylation in vitro

Le plan est de tester la phosphorylation in vitro puis de faire un western blot utilisant un AC anti-phosphotyrosine... par la suite à la place du western blot on voudrait envoyer nos échantillons phosphorylés en spectrométrie de masse.  [...] du coup ma question reste la même, pensez vous qu'il soit possible d'utiliser un protocole de phosphorylation in vitro et de remplacer l'ATPp32 par de l'ATP normal puis d'envoyer mes échantillons en M/S.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot sur des echantillons de foie murins

Pour les extraits, j'utilise ce protocole sur du foie et sur des cellules, ça revient au même. Il faut faire attention a ne pas mettre trop de tissu dans le tampon, l'idéal étant de peser environ 30mg pour voir ce que ça fait. Grosso modo, une tete d'allumette dans 500µL et tu as de quoi faire des centaines de western.  [...] un stock entre 2 et 10 est confortable. Tu peux diluer avec le même tampon qui a servi a l'extraction. D'ailleurs pour déposer en western, vu qu'il faut le même volume partout, il faut prélever une quantité d'échantillon et compléter tout le monde au meme volume avec ce tampon, c'est donc plus pratique d'en faire plus et de le conserver.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression hétérologue de protéine : vecteur baculoviral

J'imagine que tu fais une coloration de gel à l'argent pour voir ta protéine. Parfois on ne voit pas la bande. Ca ne veut pas dire que la protéine n'est pas exprimée. Comme ta protéine est tagguée tu peux faire un westernblot en dénaturant les protéines au bête beta mercaptoethanol. Normalement cela rompt les ponts.  [...] J'ai eu quelques soucis avec mes tout premiers échantillons. Je ne fais que des gels en bleu de Coomassie en attendant les anticorps pour un Western.  [...]

[Biologie Moléculaire] Régulation de NFAT5

Donc l'idée est de faire une immunoprécipitation des protéines ubiquitinilées. Puis un western anti ubiquitine permet de voir l'ensemble des protéines précipitées. Ensuite, sur le même extrait on fait un western anti NFAT5 afin de savoir si il fait partie des protéines précipitées.  [...] Le dernier panneau n'est jamais décrit dans le papier. Mais il me semble que l'idée est de voir dans quelle mesure les anticorps se sont bien fixés aux billes et d'évaluer l'efficacité du crosslink. Personnellement je n'ai jamais fais un tel contrôle.  [...]

[Biochimie] Pb échantillon gel Tris-Tricine

Je travaille sur un peptide inférieur à 3 KDa et je voulais le visualiser en western blot. Mais je rencontre un petit problème. lors de la migration en gel tris-tricine, mes échantillons se reserrent )( dans mon gel de séparation. Pb de sels Mes échantillons sont préparés avec des cellules fraîches et broyées directement dans le tampon d'échantillon.  [...] Rq. une migration test pour le même type de gel (mêmes réactifs) a fonctionné avec d'autres échantillons (culots secs congelés d'autres cellules).  [...]

Recherche de références d'un anticorps anti FAS HUMAIN

Recherche de références d'un anticorps anti FAS HUMAIN.   [...] Je dois faire un western blot de la protéine FAS à partir d'échantillons provenant des cellules HepG2. Quelqu'un aurait-il des références d'anticorps qui marchent bien.  [...]