• Forum - Hybridation, Rapport, Amorces

bandes non spécifiques

j'ai fait une PCR pour amplifier les microsatellites. mais sur le gel mon encadreur m'a dit qu'il ya des bandes noin spécifiques. s'il vous plait qu'est ce que ce la veut dire.   [...] c'est des produits de PCR qui ne sont pas issus de l'amplification de ta cible, par exemple si la température d'hybridation est trop basse par rapport au Tm des amorces.  [...]

[Biochimie] Demande de definitions

Bonjour, ça pourrait parraître bête mais bon j'arrive pas a serner la signification d' hybridation des amorces ainsi que la polymérisation.Ceci ayant un rapport avec le marquage par multiamorçage ou random priming.  [...] Falindor avait partiellement raison en parlant de l'ARN. En effet pendant la réplication chez les eucaryotes, le brin retardé est synthétisé a partir d'amorces d'ARN. Cependant on ne parle pas à ce moment d'hybridation puisque les amorces sont synthétisées directement sur place.  [...]

Température d'hybridation et PCR

Maintenant pourquoi on se place 5°c en dessous du Tm pour avoir la température d'hybridation J'y pense maintenant ça doit être un compromis entre une dénaturation suffisante de l'ADN (ou plutôt une renaturation pas trop rapide de l'ADN après l'étape de dénaturation pour permettre l'hybridation aux amorces) et une température suffisamment basse pour permettre l'hybridation (d'où 5° en dessous du Tm). Non.  [...] La denaturation s'effectue a 94°C pour séparer les deux brins d'ADN. Les amorces etant en large exces par rapport a la matrice lors de l'hybridation (a un Tm bas pour etre certains qu'elles s'apparieront) leur hybridation avec la matrice est favorisée.  [...]

[Biotechnologie] Principe de la PCR

La deuxième période s'effectue à une température généralement comprise entre 40 et 70°C, dite température d'hybridation des amorces. La.  [...] Pour la dénaturation et l'hybridation des amorces, 30 secondes suffisent généralement. Pour l'élongation, il faut compter 1 minute par kilobase d'ADN d'intérêt et 2 minutes par kilobase pour le cycle final d'élongation. Le nombre de cycles, généralement.  [...]

[Biotechnologie] Vecteur d'expression.

Décrivez les étapes (méthode de clonage, nature des amorces, condition d'hybridation, type de vecteur, gène rapporteur etc...) qui vous permettraient de préparer.  [...] un vecteur d'expression comportant 2 régions régulatrices, un promoteur P (200b) et une région amplificatrice E1 (600b) issues de 2 gènes différents. Les extrémités 5' et 3' de P et E1 sont franches et ne peuvent pas être coupées par une enzyme de restriction.   [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

Ta température d'hybridation est faible, quel est le Tm de tes amorces Peux tu nous donner la séquence de tes amorces pour les checker.  [...] A une température aussi basse d'hybridation, la stringence étant moins forte il peut y avoir une formation de structures secondaires empêchant la PCR, sur les amorces ou sur la matrice. Essayes une température plus haute comme le recommande YouLab, à 60°C, cela peut résoudre ton problème.  [...]

Conditions experimentales PCR, test primers !

Mon travail consiste a tester des couples d'amorces (primers F/R) afin de determiner les conditions experiementales pour leur utilisation. J'ai testé ces amorces avec une temperature d'hybridation standard donnée par les differents protocoles de PCR. 55°(diferente de celle indiquée sur les etiquettes des tubes des amorces) et la plus part de mes couples d'amorces ne donne pas de signal ou de signal specifique.  [...] . toutes vos idées à propos de ce que je fais me seraient utiles. determiner les bonnes conditions experimentales pour l'utilisation de differentes couples d'amorces (primers), comment savoir la bonne temperature d'hybridation, comment savoir combien de cycles de PCR pour chaque amorce.  [...]

[Biologie Moléculaire] A Propos De BioEdit !

Je Voulais savoir comment pourrais-je visualiser les sites d'hybridation des amorces après alignement des séquences grâce au logiciel Bioedit.  [...] Si j'ai bien compris ce que tu demandes, il te suffit d'aligner la séquences de tes amorces (ou le reverse complément) avec les séquences et tu auras le site d'hybridation.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR et température d'hybridation

Expérimentalement, il est constaté que la PCR fonctionne même avec une phase d'hybridation avec une température supérieure de quelques degrés au Tm théorique des amorces, probablement parce qu'elles interagissent déjà avec les polymérases, qui stabiliseraient leur hybridation à l'ADN matrice.  [...] Par contre j'ai des bandes très correctes et justement avant d'augmenter la température de deux degrés j'avais des smears. Et de deux degrés me paraissaient peut mais apparemment non, des que la température dépasse celle théorique pour l'hybridation des amorces, elles semblent alors contraintes à se fixer encore plus spécifiquement.  [...]

[Génétique] PCR, marqueur biologique

2. Hybridation des amorces qui encadrent la région que l'on désire amplifier (région d'environ 1*000 bases). Les amorces sont mises en excès -. 50-60°C.  [...] 3. Extension des amorces de 5'-. 3' via une ADN polymérase thermostable, ce qui permet de synthétiser un nouveau brin d'ADN artificiel qui sera strictement complémentaire du brin qui a servi de matrice -. 72°C.  [...]