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Carte de restriction d'un plasmide inconnu

Sachant que l'on doit choisir 5 à 6 enzymes. Deja dans un premier temps comment peut on savoir lesquels choisir préférentiellement Est ce que le choix des enzymes auraient juste avoir avec les couples d'enzymes qui ont une bonne activité ensemble pour pouvoir les coupler lors des digestion avec un même tampon Je compte faire mes digestions et analyser sur gel d'électrophorèse d'agarose à 1% (ne connaissant pas du tout la taille du plasmide je suppose qu'il a plus de chance de se trouver entre 10kb et 0.  [...] Le deuxième problème est la concentration en glycerol. Généralement, les enzymes sont suspendu dans un tampon coupé à 50% de glycerol, afin d'éviter les cycles de congélation/décongélation, qui abimeraient l'enzyme. Cependant, le glycerol est très mauvais pour l'activité de l'enzyme, et communément, ont admet que la quantité d'enzyme (+glycérol) ne dois pas dépasser 10% du volume total de digestion.  [...]

enzymes de restriction

La séquence d'ADN est le principal facteur qui détermine la spécificité d'une enzyme de restriction à couper l'ADN bicaténaire à un endroit précis.  [...] On parle alors d'activité star qui altère la fidélité de l'enzyme. Les conditions expérimentales de rapport enzyme.substrat, volume de digestion, temps de digestion, force ionique et pH des tampons de digestion, présence ± concentrée de glycérol ont toutes un fort impact sur la fidélité de l'enzyme à couper la séquence d'ADN à l'endroit désiré et pas n'importe où ailleurs.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole digestion

derniere chose, n'oublie pas qu'il ne faut pas depasser 10% de ton volume total en enzyme de restriction. Sinon le glycerol qu'elles contiennent fini par totalement perturbé ta digestion (inhibition, activité star etc...).  [...] Le top pour la digestion (selon protocole promega/ NE Biolabs, teste et approuve par tout le labo) C'est 50 uL volume final (ADN purifie, pas tout juste sorti de PCR), et max 2 uL d'enzyme. Un volume plus petit ca coupe mal, et plus d'enzyme au mieux ca change rien, au pire ca coupe mal ou avec activite star.  [...]

Second messagers

Pour ce qui est des phospho inositol, le DAG n'en fait pas partie car c'est du Di Acyl Glycérol.... L'IP3 se fixe sur un canal calcique du RE et permet l'augmentation du Ca2+ intracellulaire ce qui amène la PKC en position sous membranaire, le DAG produit parralèlement par la PKC permet ensuite l'activation de la PKC (en s'ouvrant l'enzyme permet au site pseudo-substrat inhibiteur du site catalytique de se détacher et on a une activité kinase.  [...] Bon je vais essayer de me connecter régulièrement aujourd'hui mais sans garentie car j'ai beaucoup de boulot (révélation de Western entre autre, sur l'activité Erk puisqu'on en parle... ).  [...]

[Biochimie] Comment le glycerol rejoint la glycolyse ?

je me suis mal exprimée, excusez moi, en fait je connais bien la glycolyse (toutes les étapes et les enzymes régulatrices) mais ce que j'étudie, c'est l'entrée du glycerol dans la glycolyse.  [...] J'ai fait des recherches, et j'arrive toujours à deux résultats differents. je sais qu'il y a intervention d'une glycerol kinase et une glycerol deshydrogénase et que l'un des intermediaires est le Glycérol P, mais selon mes sources, il les place pas au même endroit. Alors je sais pas trop quoi penser.  [...]

[Biochimie] Congélation : effet sur les enzymes

Par contre je peux te dire que la majorité des enzymes n'aime pas trop les cycles de congélations et de décongélations. La plupart, si tu les congeles puis si tu les décongèles, perdent leur repliement 3D et leur(s) activité(s). Pour palier à cela, on les place généralement dans du glycérol qui limite la diminution de l'activité.  [...] Dans ton cas des enzymes sont dans leur environnement naturel, donc tu pourrais faire une comparaison de leur(s) activités sans congélation et avec un cycle de congélation/décongélation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

Ensuite qu'elles sont les conditions de tes digestions Car BamHI et NotI ont une star activity qui peut être induite par une digestion trop longue ou alors par une concentration en glycerol trop importante dans ton mix réactionnel.  [...] Comme a dis Franckeeuuhh, as tu bien vérifié la quantité de glycérol dans ton mix réactionnel C'est vraiment critique pour certaine enzyme, dont NotI (moins pour BamHI, qui est plus costaude). En général, on dit qu'il faut un µl d'enzyme pour 10µl de volume total réactionnel (dans le cas où tes enzymes sont resuspendu dans 50% de glycérol). A toi de calculer.  [...]

Médicaments de l'obésité : Glycérol

L'adipocyte synthétise des triglycérides afin de stocker les acides gras. Pour ce faire il démarre de l'alphaglycérophosphate qui est obtenu soit à partir de Dihydroxyacétone-phosphate provenant du flux glycolytique grâce à l'enzyme Glycérol-3-phosphate déshydrogénase, où à partir de glycérol alimentaire avec une kinase spécifique.  [...] Le glycérol ne sert qu'au métabolisme des acylsglycérols Que se passerait-il si on inhibait l'une ou l'autre de ces enzymes.  [...]

La digestion des lipides

L'enzyme va donc agir sur son substrat et va hydroliser les triglycérides pour former des molecules plus petites d'acides gras, de glycerol et d'un alcool.  [...] Le tube 2 correspond au tube sans enzymes. Donc ton pH est de 8, et les triglycerides restent en l'etat, elles ne sont pas modifiées puisqu'il n'y a pas d'enzymes. Il n'y a pas de reaction.  [...]

[Biochimie] Conservation d'anticorps

J'aimerais savoir si certains d'entre vous ont une expérience en terme de milieu de conservation d'anticorps. je purifie des anticorps à partir de sérums humains, mais la conservation en glycérol ne préserve pas l'activité de mes anticorps dans le temps. Pour être plus précis, les anticorps que je purifie sont destinés à de l'immunocapture, mais au bout de quelques jours seulment l'activité biologique d'immunocapture disparait alors que mes anticorps sont toujours fonctionnels en western blotting ou en immunofluorescence.  [...] Je conserve mes anticorps aliquotés congelés à -20°C en PBS. Quand je décongèle un aliquot, je le garde à 4°C. Je n'ai, en général, pas de problème pour mes applications (FACS, WB, immunofluorescence). Je ne fais pas d'immunocapture et je ne peux donc pas répondre à des questions qui seraient spécifiques à cette technique.   [...]