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[Biologie Moléculaire] Encore de la Q-PCR : quantification absolue maintenant

Ma question aujourd'hui est la suivante. je souhaiterais faire une quantification absolue de mon transcrits d'intérêt pour cela j'ai compris qu'on utilisait la gamme de dilution et les Ct mais j'arrive pas à voir comment on peut revenir à une quantification de transcrits puisque pour la gamme on ne connait que la quantité total d'ARN et pas celle du transcrit.  [...] Mais je vois pas comment je peux connaitre dans ma gamme la quantité de mon transcript, je peux juste connaitre la quantité d'ARN tot.  [...]

Normalisation RT-PCR quantitative

Personnellement, je n'aime pas trop la méthode du delta delta de Ct, car je trouve que ça induit un biais supplémentaire. En effet, rien ne te dit que l'expression de ton fameux gène de contrôle n'est pas un peu modifiée quand même par le traitement. Je préfère doser soigneusement mes ARN au spectro et faire toujours ma RT avec la même quantité d'ARN (5µg) et rapporter l'expression du gène à la quantité d'équivalent ARN totaux.  [...] Par contre, il faudra peut être que tu rapportes tes Ct à la quantité de RT (ou d'ARN total initial) dans certains cas. Car parfois, il faut diluer beaucoup pour avoir un Ct correct, c'est-à-dire non saturé et hors du bruit de fond. En gros, je gardais les Ct entre 20 et 35 (mais j'avais ma gamme d'ADNg pour me guider).  [...]

[Biologie Moléculaire] Urgent: préparer gamme pr qRT-PCR

Je veux faire une qRT-PCR, pour tester mes primers que j'utilise pour la 1ère fois, on m'a dit qu'il faut que je réalise une gamme de mes cDNA. Ma collègue partait d'un échantillon à 2,1 µg d'ARN total, après la RT elle commence par diluer les cDNA au 1/4 puis au 1/10, 1/50, 1/100, 1/150.  [...] J'avais testé mes primers avec une gamme de 100/50/25/12.5 ng de RNA retro transcrit dans un volume total de 20µL (kit superscript III, INvitrogen) Ouis j'en avais utilisé 1 µL pour faire ma qPCR.  [...]

[Biochimie] Calcul de quantité de proteine

Voilà j'ai un doute concernant un calcul. En faite je fais une gamme de proteine qui me permet de calculer les proteines totales presentes dans mes essais. Cette gamme est en mg/mL. Ensuite je fais une autre manip qui me permet de connaitre la quantité d'une proteine specifique.  [...] La gamme de cette proteine specifique est en ng/mL. Or au final je veux une quantité en ng de cette proteine par mg de proteine totale. Dc je divise ma quantité en ng de proteine specifique par ma quantité en mg de prot totale. Est ce que le raisonnement est bon.  [...]

[Biologie Moléculaire] Interprétation PCRq en temps réel (SYBER Green)

Le nombre de copie permet de revenir à une sorte d'unité internationale, car à partir des conditions expérimentales qui peuvent varier d'un manipulateur à l'autre (quantité d'ARN de départ, conditions de qPCR, mix utilisés etc...) les Ct peuvent varier. Après une normalisation par un gène de ménage défini et/ou l'utilisation d'une gamme étalon, on s'affranchit de ce genre de problème.  [...] Tu peux donc effectivement définir un pourcentage de contamination par rapport à la quantité totale d'ADN (ce qui me paraît être le plus simple).  [...]

Estimation concentration gel agarose

Pour connaitre la concentration il faut utiliser un spectrophotomètre micro-volume (type Nanodrop), c'est la seule façon de réellement connaitre la quantité d'ADN présent.  [...] sans expérience il est aussi possible d'approximer en faisant une pseudo gamme a partir de concentrations d'ADN connues et comparer les tailles des bandes de quantité connus avec la taille de ta bande de quantité inconnue, mais c'est vraiment pas précis et pas pratique, en gros je pense que c'est la raison pour laquelle tu as mis plusieurs quantité de geneRuler, tu regarde a quelle taille  [...] tube du geneRuler ou sur la notice tu dois pouvoir trouver la quantité (soit la quantité par microlitres, soit la quantité totale et a ce moment tu divise par le volume du tube) puisque tu as la quantité d'ADN dans le tube de Ruler ( quantité par microlitre) et que tu sais le volume que tu as déposé (2, 4 ou 6 microlitres), tu connais la quantité d'ADN pour chaque epaisseur de bande de Ruler que tu as déposé et ensuite tu en déduis la quantité de ta bande inconnu par rapport a la taille de la bande de chaque ruler dont tu connais maintenant la quantité déposée en nanogramme et la taille de ta bande de concentration inconnue,  [...]

[Biologie Moléculaire] Dosage des ARN à l'orcinol

Pourquoi le ration purine/pyrimidine serait il de 1 dans les ARN Ceci ne vaut que pour l'ADN double brin. Il faudrait retrouver le tableau avec les %CG en fonction des organismes (je l'ai pas retrouvé en cherchouillant vite fait sur le net). Maintenant il faut aussi tenir compte du fait que le dosage spectro n'est pas une méthode de dosage absolument précise avec les appareils classiques.  [...] Donc, j'ai une remarque à faire. ta gamme étalon, si tu l'a faite avec l'ARN commerciale de levure, il n'y a pas de différence dans le rapprot C G, ton absorbance est proportionnelle à ta concentration. Il y aurait un soucis seulement si l'ARN de ta gamme vient d'une espèce différente de la levure dont tu doses l'ARN.  [...]

[Biochimie] Quantifier un western blot

Il existe des appareils spécialisé (genre chemigenius), qui permette d'acquérir des images jusqu'à 65 000 niveaux de gris, couplé au logiciel genetool pour faire une analyse automatique (identification des pistes et des bandes, determination de la taille/poids moléculaire par rapport à une marqueur, détermination de la quantité par rapport à une gamme standard).  [...] le film a une gamme de réponse linéaire, le substrat aussi, la quantité d'anticorps joue aussi un rôle. C'est pour cela que l'idéal est d'avoir une gamme de quantité sur le même gel, et sur la même expo de la même protéine, pour t'assurer que tes conditions sont bien quantitatives.  [...]

[Biologie Moléculaire] QPCR, courbe Tm?

Si ces primers sont connus pour etre bons, (teste par ton labo avec courbe de fusion a l'appuis ou publie et sans moyen de regarder les courbes), alors c'est soit quelque chose qui a change dans ta manip (origine du mix annealing concentration des primers etc) et si ce n'est pas le cas, c'est que soit tes primers sont devenus mauvais avec le temp (ou contamine par quelque chose) soit que ton ARN/cDNA est different et qu'il requiert une optimisation (genre quantite d'ARN plus faible, du coup moins de cDNA, du coup les primers sénnuient et se dimerisent ).  [...] Ca n'a rien a voir, la courbe de fusion n'est pas dependante de ta gamme etalon. Par contre ta gamme etalon doit comporter plus de 3 points (au moins 6 a 7 log) et elle pourra te renseigner si c'est un probleme de quantite de template ou pas.  [...]

[Biochimie] Protocole de purification d'une protéine, vos avis

Moi je rajouterai juste une RNASe et DNAse à ton échantillon pour me débarassé de l'ADN et l'ARN. Si tu veux garder l'activité beta-gal il ne vaux mieux pas la précipiter sinon ca risque d'etre difficile.  [...] Je ne connais pas ma quantité de protéine dois-je réaliser une gamme étalon pour déterminer les quantité de protéines de mes solutions.  [...]