• Forum - Fragments, Digestion, Enzyme, Restriction

[Microbiologie] banque de gènes

mon encadreur m'a demandé de faire une banque de gène, est il possible d'obtenir plusieurs fragments de gène en faisant la digestion par une seule enzyme de restriction et comment.  [...]

Banque d'ADN

Les banques d'ADNg ne permettent pas d'isoler de gènes en particulier, mais plutôt des fragments d'ADN, qu'on doit par la suite cribler.  [...] Et n'oublions pas qu'une bonne banque se doit d'être un minimum redondante, et que la taille des fragments n'est pas choisie au hasard en fonction de ce qu'on veut en faire.  [...]

[Biologie Moléculaire] Calcul de rendement

Bonjour. Voilà en ce moment je réalise des TP de biomoléculaire. On me demande de réaliser un calcul de rendement de purification des fragments obtenus lors d'une digestion. pCR-GAI digéré avec BamH1 et Hind III, 2 sites de restriction pour chaque enzyme.  [...] En réalisant une électrophorèse sur la purification obtenue, on obtient les concentrations finales des fragments (dont le 5'gai de pCRgai, estimé à 5ng/µl, ce qui est peu), en comparant la luminosité des bandes.  [...]

Carte de restriction de Pcr-GAI

Bon apparemment on dispose de BamHI donc dans ce cas on peut libérer le 5' GAI en utilisant HindIII et BamHI et ensuite le faire digérer séparément par XhoI et BglII si on obtient deux fragments par digestion, on a les deux sites de restriction sur le 5' GAI (donc dépend d'un coup de chance) sinon il faut (pour améliorer la carte de restriction) obligatoirement isoler le 3'GAI avec EcoRI et HindIII et le mettre en contact avec l'enzyme dont on cherche encore le site de restriction.  [...] J'ai peut être oublié de préciser que je n'ai jamais établi de carte de restriction ^^'. En fait je ne vois pas du tout comment placer les sites de restriction rien qu'en regardant une électrophorèse...Car finalement on aura des fragments de différentes tailles à mettre bout à bout mais dans quel sens.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de construction d'une banque d'ADNc

Je tiens à vous dire que pour digérer mes fragments j'utilise l'enzyme de restriction Sfi I et ce à 50°C pendant 2h.  [...] La vérification du clivage des ADNc par une enzyme de restriction peut se faire si le clivage génère des fragments de taille différente et suffisamment longs. Ainsi par migration sur gel d'agarose, la présence des bandes d'intérêt permet de valider le clivage.  [...]

[Biologie Moléculaire] Marqueurs dominants et codominants

Par contre, je ne comprends pas ta première question... Les marqueurs RFLP sont codominants... Je ne vois donc pas ce qui te chagrine.   [...] l'enzyme de restriction coupe au niveu du site de restriction et doit générer 2 fragments de restrictions pour le homozygotes et les hétérozygotes.  [...]

[Biochimie] Preparation et analyse de plasmides

donc, avant digestion, on regarde la tête de l'ADN *non digéré* sur gel. Après digestion, on compare. si notre ADN a la même tête, c'est FAIL. si on a des bandes qui correspondent à ce qu'on a calculé d'après les positions des sites de restrictions (les regexp), c'est PASS.  [...] La carte circulaire comme tu dis (= la carte de restriction) se fait après l'électrophorèse. Tu ne peux pas prédire le nombre de fragments que tu auras (à part si tu connais la séquence complète de ton plasmide).  [...]

[Biochimie] Enzyme de restriction

Je voulais avoir une petite précision sur les enzymes de restriction. Dans mon exercice j'ai un tableau avec différentes enzymes de restriction et les séquences clivées correspondant a chaque enzyme. Cela veut dire que si j'ai par exemple pour une enzyme X, la sequence clivee.  [...] Je dirais plutôt que l'enzyme de restriction va cliver à l'intérieur de cette séquence et générer ainsi 2 fragments soit à bouts francs soit cohésifs. Elle peut cliver en plein milieu ou après un nucléotide ou trois nucléotides, tout dépend de l'enzyme.  [...]

[Biologie Moléculaire] Connaitre séquence génomique....

digestion de restriction avec plusieurs enzymes dont les séquences ne reviennent pas trop souvent (digestions simples et doubles histoire d'avoir les fragments avec plusieurs origines et fins différentes.). Tu as une idée de la complexité du génome (tu peux faire des essais pour voir la taille moyenne des fragments que tu rammènes). Tu fais une banque avec tout cela.  [...] Pour la PCR inverse, il peut être intéressant d'utiliser une 2eme enzyme de restriction située entre les 2 amorces, de manière à relinéariser le brin d'ADN circulaire. Cela facilite la PCR sur des petits fragments.  [...]

[Biochimie] Insertion vecteur

la digestion de restriction. Tu choisis un site unique du vecteur qu'on retrouve aussi dans l'insert, tu digères et en fonction du nombre et de la taille des fragments tu peux dire s'il y a insertion et même si elle est bien orientée.  [...] Ok.merci on a choisi la PCR avec des amorces car la digestion de restriction je ne l'ai pas vu en cour. Par contre l'autre soucis c'est de savoir ensuite si je choisi une PCR/RFLP ou PCR/RAPD car meme avec les avantages et inconvénients des 2 je n'arrive pas à choisir.  [...]