• Forum - Fragment, ADN, Vérification, Clonage

[Biologie Moléculaire] vecteur de clonage et le vecteur d'expression

Un vecteur d'expression est un vecteur dans lequel on va cloner le même fragment d'ADN après vérification du clonage dans le vecteur de clonage (taille de l'insert, séquence...) et grâce à son promoteur (constitutif ou inductible) ce vecteur va diriger la bactérie hôte d'expression pour produire la protéine d'intérêt.  [...] I) Définition des vecteurs. Petites molécules d'ADN possédant leur propre système de réplication. Ils servent de véhicule pour le clonage génique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment ajouter un petide signal à une proteine?

Mais deux seulement suffisent. La premiere, qui amplifie le peptide signal, avec sur une des amorces un site de restriction (cohesif), que tu rajouteras egalement sur le sequence de la CFP de la meme maniere (sauf bien sur si c'est une CFP commercial, avec deja un bon choix d'enzyme qui coupe ou il faut).   [...] Tu peux ensuite purifier tes fragments, les digerer, les repurifier puis faire le clonage (transformation, amplification, verification) et hop, le tour est joue. Durer moyenne pour un tel clonage. une semaine max, sans compter le temps necessaire pour commander les amorces.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de ligation??

Pour la vérification du clivage des inserts, il n'y a pas vraiment de méthode rapide de vérification si ce n'est la réussite du clonage lui-même. Si les parties flanquant les sites de restriction utilisés sur l'insert sont suffisamment longues, en migration électrophorétique tu verras une bande spécifique du clivage apparaitre, c'est à ma connaissance le seul moyen de vérifier si cette étape marche.  [...] une bande à 800 pb (insert), à 1600 (dimère d'insert), 2400 pb (trimère),...Cela montre que l'insert se ligue à lui-même grâce au fait qu'il soit clivé par la même enzyme de restriction à chacune de ses extrémités. Pour un clonage orienté, je doute que cette vérification soit aussi évidente.  [...]

[Biologie Moléculaire] perte spontanée d'insert lors du clonage

- plasmide sensé avoir inseré mon fragment dans le bon sens (ce qui est en réalité après vérification par pcr et par digestion ne contenant pas du tout mon insert) = entre 10 et 20kb.  [...] -plasmide sensé avoir inseré mon fragment dans le bon sens et digéré avec sacI lors de la vérification = toujour entre 10 et 20kb mais un peu derrière du même plasmide non digéré (ceci est valable pour toutes les 4 clones).  [...]

[Biologie Moléculaire] mutation génétique

Si l'amplification fonctionne sur l'ADN génomique et bien je remettrais en cause l'expression transcriptionnel de l'ARN et probablement une mutation sur le promoteur et/ou les éléments régulateurs qui contrôle le CDNA mais sa n'expliquerais toujours pas pourquoi une partie de l'ARN est plus transcrite qu'une autre (le segment 11) et est ce que cela est possible dans la nature, transcrire un exon plus qu'un autre sachant que les deux exons sont sous le contrôle d'un même promoteur.  [...] Ceci dit, il n'a pas la même différence de signal quand il amplifie de l'ADN génomique, ce qui en principe exclue les différence d'efficacité des amplifications. il faudrait vérifier que les amplifications sont vraiment toutes également efficaces en partant de moisn d'ADN génomique au départ et/ou en déposant des dilutions de tes produits de PCR génomiques, car il est probable que le fort signal que tu vois pour chaque soit saturant même pour le produit le moins efficacement amplifié.  [...]

mitochondries a l'origine du vieillisement

les mitochondries agees seraient a l'origine du vieillissement humain, les molecules d'ATP sont de moins en moins produites et les radicaux superoxyde prennent la place des radicaux libres, comment fonctionne ceci.   [...] Les mitochondries renferme une partie de leur ADN. cet ADN est abimé par la proximité de nombreux composés altérants. radicaux libres et autres oxydants. De plus leur ADN ne possède pas tous les mécanismes de vérification de la réplication, à la différence de l'ADN nucléaire.  [...]

[Biologie Moléculaire] le gel idéal??

Le plus bas que j'ai fait c'est 0.4% d'agarose et ça pouvait encore allé, d'où ma remarque sur le 0.2%...C'est vrai que ça fait peu. Déjà si tu fais un 0.6% ce sera mieux en effet. Mais ton but n'est apparemment pas de séparer des fragments d'ADN génomique, c'est plutôt pour voir si ta purif a bien marché, je me trompe Dans ce cas l'important est que ton ADN génomique rentre dans le gel pour vérifier la netteté de la bande, afin de voir s'il n'y a pas de dégradation qui causerait un smear en-dessous.  [...] Parce que effectivement la bande du haut s'avèrerait être de l'ADN. D'autant que les ADN c'est très gros et ça ne migrent pas bien loin. Après tu veux en faire quoi de ton ADN Une PCR de vérification serait peut-être pas mal.  [...]

[Biologie Moléculaire] Différence entre PCR ET Clonage

En TP, on nous a demandé de bien faire la différence entre la PCR de vérification des recombinants et la PCR de clonage. Cependant, je n'arrive pas vraiment à distinguer les deux méthodes, à part qu'on utilise.  [...] pas le même matériel. Sur internet aussi ils font la distinction, mais ça ne reste pas très clair dans mon esprit, si quelqu'un peut mieux m'éclairer.   [...]

real time pcr

Donc bon, si on met assez de trizol et que l'on laisse incuber assez longtemps on a pas de contamination. D'ailleurs, je me suis mal exprimé en disant bouffer. Ca n'est pas une dégradation de l'ADN mais simplement une séparation dans les phases. On a même reussit à faire des PCR à partir d'extraction trizol (m'enfin c'est lourdingue à faire).  [...] A mon avis, la vérification sur gel permet de visualiser une grosse contamination par de l'ADN génomique, mais s'il en reste quelques ng, ça ne se verra pas. Je préfère contrôler l'absence de contamination par de l'ADN génomique en faisant une PCR avec des oligos spécifiques d'un intron.  [...]

Maladie de Crohn et RCH - Page 208

le fais que je sois né un 1er janvier ou un 1er juillet ne change pas le fais que mon adn(tu en parlais tout a l'heure) reste strictement le meme enfin bon j'aimerai quelque explication la dessus si tu le veux bien.  [...] Dans ta réponse sur l'ADN, c'est logique que ce soit les 2 puisque, si ma mémoire est bonne), phénotype = génétique + environnement. Et là, je fais appel à Yoyo pour vérification.  [...]