• Forum - Fixation, Protéine, Séquençage

[Biochimie] reaction d'edman

bjr. j'ai un petit souci, mon prof a parlé de la reaction d'edman ds un de ces cours. je comprends l'interet, la fixation entre le PITC et le 1er nh2 de la proteine mais j'ai du mal a comprendre la suite pr faire le sequencage. on fait plein de liaisons comme ca a la suite mais comment sait on quel AA s'est fixé.  [...] Le PhynylThioHydantoine-aminoacide est injecté dans une colonne chromatographique. (affinité en phase inverse ou autre.).le temps de rétention est déterminé et ceci permet de caractériser le PTH-AA en sortie de colonne.   [...]

[Biologie Moléculaire] Séquences et taille de protéine

Voilà, mes connaissances en séquençage ne sont pas très étendues, et là on a commandé des primers pour une protéine donnée, et mon chef me demande à partir des primers de prévoir la taille de la protéine, de voir s'il y a des introns dans la séquence etc,  [...] Pour la question principale je pensais qu'il s'agissait d'un séquençage protéique, mais on parle de primer... de quel type de séquençage s'agit-il DNA ou protéine.  [...]

Alignement séquence (Bioinformatique)

Dans notre labo, nous avons commencé à faire du séquencage de protéines. Nous recevons les données et nous les alignons avec une séquence de référence dans NCBI pour savoir si notre protéine est bien présente dans notre plasmide. Le séquencage n'est jamais parfait alors, lorsque je fais ces alignement jobtiens pleins de fragment des séquences homologue.  [...] Salut, oui il y a notre protéine que nous avons transfecté dans un plasmide. Nous l'avons verifier par blast avec la sequence de cette protéine de NCBI (reference). Et nous obtenons pleins de petits fragments d'alignement, ce qui est normal puisque lors du séquencage le logiciel fait pleins d'erreurs et donc l'alignement ce fait moins bien, ce qui crée ces fragments.  [...]

[Biologie Moléculaire] [biologie moleculaire] Le code génétique

Tu oublies que la plupart des gènes et des protéines avec lesquels nous travaillons (enfin du moins moi) sont issus d'un clonage à partir de la protéine (séquençage de la protéine puis recherche du gène). Si un système à 4 bases par codon existait, il y aurait eu un bug dans cette méthode.  [...] Car faut pas perdre de vue que purifier une proteine pour la sequencer c'est plus que fastidieux, c'est souvent extremement difficile etant donne le faible niveau d'expression de la plus part d'entre elles (et tu ne peux pas les sur-exprimer puisque tu ne connais pas le gene.). Et le sequençage de proteine ca coute cher.  [...]

séquençage d'une protéine : méthode de sanger

Après que le réactif de Sanger ait régit avec la chaîne d'acides aminés et qu'il y'ait eu hydrolyse en milieu acide je ne vois pas comment à parti des produits obtenus ( AA terminal combiné au réactif de Sanger et reste des résidus séparés) on peut identifier l'acide aminé auquel on a à faire et je n'ais pas vraiment trouvé d'info sur le sujet.   [...] Les acides aminés sont analysés par une méthode chromatographique (par ex. l'HPLC) et comparés à des standard, afin de les identifier.   [...]

Immunoprécipitation de la chromatine

La ChIP permet d'identifier le site de fixation d'une protéine sur l'ADN. Il faut posséder l'anticorps spécifique de la protéine qui t'intéresse (ou alors exprimer une protéine taggée dans ta cellule et avoir un anticorps anti-tag). Donc tu extrais les complexes ADN/protéines des cellules, tu les découpes en courts fragments (qq centaines de paires de bases par exemple pour commencer) tu incubes avec ton anticorps.  [...] Tu isoles les complexes formés Ac/protéine/ADN. Séquençage de l'ADN = tu peux identifier le site de liaison de ta protéine dans le génome.  [...]

[Biochimie] Etude des protéines par spectrométrie de masse

Bonjour à tous, j'ai un problème de compréhension avec la spectrométrie de masse, j'ai compris qu'il y a plusieurs types de source d'ionisation et plusieurs types d'analyseur qui peuvent être couplés entre eux de multiple manières. Mais je ne comprend pas quel est l'intérêt d'utiliser plutôt l'une ou l'autre (particulièrement ESI ou MALDI) de ces sources d'ionisation sachant qu'au final on aura un spectre m/z. Quelqu'un pour m'éclairer.   [...] De plus, la source ESI est facilement couplée à une chromatographie liquide qui va entrainer la séparation des peptides avant l'entrée dans le spectro. Il est bien sur possible de le faire avec un appareil MALDI-TOF mais ca prendra beaucoup plus de temps puisqu'il faudra faire des gels à 2 dimensions par exemple pour séparer au maximum nos protéines puis faire l'extraction de chaque spot, reduction alkylation et digestion qu'on dépose sur la plaque MALDI (aujourd'hui la robotisation fait qu'il est possible de coupler une chromatographie liquide au MALDI).  [...]

[Biotechnologie] Maldi-tof ms

bonjour tout le monde, pourquoi on ne peut realiser un PMF ( empreinte peptidique massique) que lorsque le génome est complétement identifié.   [...] Pour faire de l'identification de proteine en partant d'une partie des peptides de cette proteine (ce qui est fait en sequençage proteique) il faut avoir un patron contre lequel aligner les peptides identifiés, i.e un génome.  [...]

But d'une PCR

Tu immunoprécipites une protéine. Celle-ci est accrochée à un fragment d'ADN. Du coup tu récupères ce dernier. Mais ta machine de séquençage sera bien incapable de séquencer une seul brin d'ADN. Il faut d'abord que tu l'amplifies.. Ainsi tu auras des centaines de copies et la machine sera capable de faire le séquençage.  [...] pour quantifier l'expression d'un gene donné ou détecter sa présence (car indétectable sans amplification), pour faire des mutations puisqu'il faut modifier une ou plusieurs bases ce qui n'est pas possible sans élongation, pour le séquencer... C'est tellement vaste, n'hesite pas si tu veux des précisions.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de ligation??

j'ai cloné un fragment de ma protéine dans un pcDNA3-V5-His TOPO (3.0), cependant je n'ai pas d'expression de ma protéine, en sachant que la ligation a été faite et le sequencage aussi et c'est niquel.  [...] Ce que tu peux ensuite contrôler si tout ceci a fonctionné, c'est si EcoR1 clive bien le vecteur après l'action de BamH1 (ou l'inverse). clivage vecteur avec BamH1 puis ecoR1 (ou l'inverse) et ligation puis transformation. Normalement tu n'auras aucune colonie, mais je te conseille de faire un témoin clivage BamH1 + ligation + transformation, car le second clivage n'est pas forcément fiable à 100%, donc la présence de quelques colonies ne veut pas dire qu'EcoR1 derrière BamH1 est totalement inefficace.   [...]