• Forum - Extrémités, Fragments, Restriction

[Biologie Moléculaire] Aflp

-ligation d'adaptateurs aux extrémités des fragments de restriction.  [...] ma question est.comment on peut faire une amplification selective des fragments de restrictionj'ai lue que la selection est faite parapport à une base mais jai pas bien compris.  [...]

Purification Séphacryl S-400

Sephacryl S-400 High Resolution to separate polysaccharides, macromolecules with extended structures and even small particles such as plasmids. (fractionation range globular proteins 2 × 104–8 × 106).   [...] J'aurais voulu savoir si le séphacryl S-400 permettait d'éliminer efficacement la Taq pol, car actuellement je voudrais faire du clonage par restriction/ligation. Je sais que la taq pol peut être gênante après digestion des fragments PCR par des enzymes de restriction, puisque les résidus de Taq pol viendraient potentiellement compléter les extrémités collantes.  [...]

[Génétique] AFLP Amplified Fragment-Length Polymorphism

J'essaye de comprendre cette technique (AFLP) et d'après ce que j'ai lu. l'ADN génomique est digéré par deux enzymes. Des adaptateurs sont ajoutés aux extrémités des sites de restriction. Les amorces peuvent ensuite se fixer sur les fragments obtenus et ceux-ci sont amplifiés.  [...] La PCR peut être réalisée en plusieurs étapes. une première avec des amorces dont la séquence est identique à celle des adaptateurs et qui amplifie ainsi tous les fragments. la seconde avec des amorces possédant de 1 à 3 nucléotides supplémentaires en 3' sélectionnant ainsi un plus petit nombre de fragments étant donné que ceux ci peuvent être très nombreux.  [...]

Enzyme compatible, non compatible

- On dispose de 2 enzymes de restriction compatibles lorsqu'elles produisent des fragments de restriction qui peuvent s'associer par complémentarité des bases si ce sont des extrémité cohésives, mais qu'en est t'il lorsque ce sont des extrémités franches.  [...] Parceque malheureusement on ne choisi pas les sites de restrictions présents dans le génome. Du coup il faut faire avec ce que l'on a. En utiliser deux permet d'orienter ton fragment ce qui peut avoir un interet certain. Il peut aussi y avoir une multitude de raisons pratiques mais je pense que c'est en dehors de tes préoccupations.  [...]

[Biologie Moléculaire] séquençage ADN

Au début du message je signalais que ces plasmides de TA cloning dérivaient du pUC. Ils sont optimisés pour améliorer le rendement du clonage des fragments de PCR. Du coup en ouvrant un pUC tout bête avec une enzyme de réstriction qui génère un fragment à extrémités franches tu devrais pouvoir cloner tes PCR mais le rendement ne sera peut être pas très bon.  [...] Tu as intéret si tu veux optimiser tes chances de cloner (c'est valable pour tout clonage et pas seulement le pDrive) à purifier tes fragments de PCR avant de procéder à la ligation.  [...]

génie génétique

Bonjour à tous, lorsque l'on veut insérer un fragment de restriction dans un plasmide pour pouvoir produire des clones, si ce fragment a 2 extrémités identique il pourrait se combiner avec extrémité du plasmide dans un sens aussi bien que dans l'autre alors comment grâce à enzyme de restriction peut-on choisir dans quel sens on veut que ce fragment se positionne.  [...] On peut choisir de fabriquer un fragment dont chaque extrémité présente un site de restriction différents ET qui sont aussi sur le plasmide, comme ça le fragment ne pourra s'insérer que dans un sens qui est celui sur le plasmide de clonage. ok.  [...]

ADN de séquence inconnue, choix des enzymes de restriction.

Si j'ai un fragment inconnu j'aurais tendance à ne pas essayer de couper mais à utiliser la Klenow ou la TNK4 pour rendre les extrémités du fragment franches. Du coup, j'ouvre le vecteur avec une enzyme de restriction qui génère des extrémités franches, et dont le site de restriction se trouve dans la cassette de clonage, et je ligue.  [...] Comme vous n'avez aucune idée de la carte de restriction de votre fragment, il est déconseillé de digérer par une enzyme, vous risquez de le casser. En revanche, vous pourrez toujours l'insérer dans un plasmide ouvert avec une enzyme générant une extrémité franche, sous réserve qu'il ait lui même les extrémités franche. Or vous ne savez rien de cela.  [...]

PCR, template et riz anti-alzheimer

- pour faire cela, on prend des amorces sens et anti-sens (type AB-5'-HindIII et AB-3'-XhoI, donc entourant le gène d'intéret) contenant des sites de restrictions et on fait une PCR.  [...] 3) les sites de restriction permettent en effet que les extrémités de tes morceaux soient cohésives. Donc on peut extraire un fragment entre certains sites, et si on choisit bien son plasmide receveur, l'insérer de facon orientée.  [...]

Carte de restriction

Disons que l'enz 1 coupe aux deux extremités et le site de restriction sur lequel va agir une enz2 soit formé soit aboli va se trouver au milieu, d'apres ce que j'ai compris, si le site est aboli= pas de coupure au milieu par l'enz2 et nous aurons juste les coupures aux extremités par l'enz1 ce qui va former un seul fragment, maintenant si on l'hybride avec une sonde, qui s'hybride avec la partie vers le milieu de le séquence on aura logiquement un seul trait dans l'electrophorse non vu que la sonde va s'hybrider avec le fragment.  [...] En gros (sauf dans des cas particuliers qui ne te concerne pas je pense), une electrophorese classique te permet de visualiser tous les fragment d'ADN (ta sonde ne sert à rien car elle ne se fixe sur rien). Un Southern blot te permet grâce à une sonde de visualiser uniquement des fragments ayant une séquence complémentaire à ta sonde (là, ta sonde est utile).  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

Notre plasmide a été digéré par EcoRV, qui génère des extrémités franches. Ces extrémités ne sont pas compatibles avec les extrémités des produits de PCR. Car la Taq pol rajoute un nucléotide (souvent dATP) sur 3'OH des fragments néosynthétisés. Donc pour que ce soit compatible les extrémités du vecteur doivent porter dTTP en 3'OH.  [...] Bon je ne comprends pas alors pourquoi mon prof m'a dit que si le gène était là et que le plasmide soit ouvert ou non,il pouvait s'exprimer quand même. Car à la base j'étais partie justement dans l'hypothèse que si les plasmides n'étaient pas refermés et bien la bactérie ne pouvait pas pousser sur un milieu avec de l'ampicilline car il n'y avait plus la résistance, d'où l'utilité donc de ce témoin... Ralala, ça m'a embrouillé du coup.   [...]