• Forum - Extraits, Cellules, Protéine

[Biologie Moléculaire] Sélection ARNm spécifique puis RT-PCR

Je dispose au départ des ARN totaux extraits de cellules exprimant la protéine étudiée.  [...] oui c'est exactement ça... D'abord la RT qui transforme TOUT tes ARN en ADNc. Puis une PCR (ou qPCR) avec les amorces spécifique à ton gène d'interet...Faut juste être sûr de ces amorces, et pour ça faut séquencer puis blaster...le mieux est de le faire sur ADNg et ADNc (et tu compares.   [...]

[Biochimie] Casser des aggrégats

Tu dis que la protéine que tu veux voir forme des aggrégats mais cela dans des extraits cellulaires. A moins que des aggrégats ne se forment que dans des extraits de cellules surexprimant ta protéine et pas dans des extraits ne la surexprimant pas, tu ne peux pas dire que ces aggrégats sont ta protéine.  [...] Tu peux peut-être diluer tes extraits cellulaires et bien vortexer en chauffant modérément (65°C). Ca marche avec les aggrégats d'ADN donc peut-être ça marchera avec les aggrégats protéiques, sans garantie.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pull down GST

j'essaye de produire une protéine en fusion avec la GST afin de faire des tests d'interaction pull-down avec des extraits cellulaires.  [...] Je souhaite donc fixer ma protéine en fusion en GST sur une colonne pui ensuite faire passer mes différents extraits cellulaires afin de déterminer des éventuels partenaires de ma protéine.  [...]

[Biochimie] Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

Exemple d'applications ben comme dans le sujet que j'ai mis en lien ^^ (pour détecter des protéines ubiquitines, c'est à dire des protéines qui marquent les protéines à éliminer, éliminés par les protéasomes situés dans les noyaux et cytosoles des cellules d'ailleurs).  [...] Alors, pourquoi ne pas utiliser un Ig@ubiquitine Simplement, parce que vous verriez les bandes shiftées de PCNA mais vous ne sauriez pas dire de quelle protéine il s'agit. Or ce que vous voulez affirmer c'est qu'il s'agit de PCNA ubiquitinylé. Maintenant, la question que je me pose (mais vous devez avoir la réponse dans un coin ou même peut être dans la légende que je n'ai pas lu) c'est pourquoi il y a autant de PCNA dans leurs extraits et à priori dans leurs cellules.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression hétérologue de protéine : vecteur baculoviral

Je fais déjà une production cytoplasmique chez coli. Si je mets du KI c'est justement pour éviter au maximum les corps d'inclusion. Outre la structure, il me faut la protéine en forme pour les études fonctionnelles Donc, si je dois choisir entre jongler avec un tas de solutions chimiques qui l'agressent et jongler en bio mol pour la faire produire dans des cellules plus adaptées, je préfère la seconde solution.  [...] Je resuspends dans un tampon 50mM Tris-HCl pH 7,7 + 10% sucrose (il paraît que ça stabilise la protéine, je ne sais pas comment) + 0,4M de KI. Je casse les cellules en sonication, mais je pensais à passer à la french press, il paraît que c'est mieux.  [...]

[Biochimie] etude de proteine de liaison à l'ADN

A priori je dirai immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), dont le principe consisite à fixer la séquence d'ADN à laquelle tu t'intéresse sur des billes d'une colonne de chromato, puis à faire passer dans cette colonne les protéines dont tu suspectes la liaison à la séquence considérée. Après élution, tu récupères la protéines liée.  [...] Selon les cas, tu peux vérifier quelle protéine interagit avec ton ADN en ajoutant a ton mix ADN+ protéines un anticorps dirigé contre ta protéine d'intéret. Dans ce cas deux solutions.  [...]

[Biologie Cellulaire] Western Blot ATM phosphorylé

Si la protéine est nucléaire, tu devrais essayer de faire des extraits de protéines nucléaires pour enrichir ton extrait.  [...] Sinon, vous êtes en culture cellulaire. Qu'est ce qui vous empêche de faire une grosse quantité de boite, d'extraire vos protéines pour les concentrer.  [...]

[Biochimie] Extraction protéine de cerveau pour IP

je souhaiterai faire une IP d'une protéine en fusion avec MBP et des extraits protéiques de cerveau de souris.  [...] Je souhaiterai savoir si vous auriez un protocole d'extraction de protéines à partir de cerveau.  [...]

[Biologie Moléculaire] PM de ma protéine trop grand

Que ce soit bien la GSK-3ß reste à vérifier, mais sachez qu'en WB on parle de PM apparent. En effet la distance de migration dépend de plusieurs facteurs qui peuvent varier entre les extraits protéiques expérimentaux et le marqueur commercial. quantité de protéines, concentration en sels, etc.  [...] L'idéal pour être sur est de disposer d'une protéine recombinante, d'extraits ou la protéine est inhibée (siRNA, animaux KO, etc) ou surexprimée.  [...]

[Biochimie] Résultats de purification de lysozymes

Ensuite on a effectuer une électrophorèse, l'électrophorèse étant qualitative, il faut de forte concentration en enzymes (ça je le sais...) dans la fraction Fo (ya toutes les protéines) F1(adsorption) F2 à F4 (normalement que les protéines - voir rien du tout en F4) c'est le lavage, puis la désorption en F5 et F6 ( ou on ne doit avoir que du lysozyme au vue de mes résultats que j'affiche plus bas) tout a marché sauf en F4 où il n'y a que du lysozyme.  [...] F0 contient toute les protéines on lui fait subir l'adsorption on obtient normalement F1 (protéines plus lysozyme non fixé) plus le culot (cm cellulose avec les lysozymes fixée).  [...]