• Forum - Extraction, Problèmes, Kit

Dégradation des ARNs DNAsés ?

J'ai un petit soucis avec mes manips en ce moment. En vue de quantifier des ARNm spécifiques, une extraction d'ARN au trizol à été effectuée, puis Dnase des RNA (avec RQ1) et RT avec oligo dT, puis finalement PCR radioactive. Le problème, c'est que les témoins pour la PCR ont marché, mais aucun de mes ARN n'a été amplifiés.  [...] Est il possible pour toi de faire une extraction de tes ARN via un kit Qiagen Il n'utilise pas le Trizol et est peut etre moins dégradant. Pour info, je fais mes extractions en kit Qiagen et je passe par l'étape facultative de DNaseI. Je n'ai jamais eu de problèmes personnellement.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

En fait je digère avec XbaI (qui se liguera à SpeI en perdant le site de restriction donc) et avec SacII pour l'autre extrémité... Après digestion, extraction sur gel et purification, je procède à la ligation... et à mon avis le problème c'est ça.  [...] Sinon les problemes liées à l'extraction des bandes des gels sont la conséquence d'un mauvais rendement d'extraction J'utilise le kit de promega et personnellement je n'ai jamais eut de probleme, mais comme piwi j'essaye au possible de ne pas passer par la, a cause de la quantité d'ADN perdue.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème d'extraction d'ARN

A priori, une extraction au Trizol permet d'éviter les problèmes dus au mucus mais ça m'arrangerait vraiment d'utiliser le kit.  [...] Si je ne me trompe pas, les mucus sont généralement constitués de polysaccharides. Normalement dans les kits d'extraction d'ARN, il y a une étape de solubilisation dans de l'éthanol 70%. Essayes peut-être de répéter cette étape, qui permet en priorité de se débarrasser des protéines en les précipitant, mais cela peut peut-être aider à se débarrasser aussi des polysaccharides du mucus.  [...]

[Biochimie] Mecanisme de ligation SOS clonage

D'après ce que tu dis tu purifies ton ADN par extraction sur gel Pour l'avoir aussi utilisé, la perte du matériel est énorme. Il vaut mieux purifier avec un kit de purification comme le PCR extraction kit (Qiagen) où la purif se fait directement sur ton produit de PCR, sans passer par un gel.  [...] Concernant la purification de l'ADN, je purifie tout le temps à partir d'une extraction sur gel et ça ne pose pas de problèmes (en utilisant le kit macherey), cependant tu peux passer ton agarose fondue et produit de PCR 2 fois sur la même colonne c'est à dire que tu reprends ce qui est passé et tu le repasses, tu auras d'avantage d'ADN.  [...]

PCR sur pseudomonas aeruginosa

), extraire l'ADN avec phénol et chloroforme, extraire l'ADN en rajoutant une étape avec du CTAB tout en ayant déjà testé certains kit d'extraction commo le DNeasy tissue kit de QIAGEN...Le problème touche uniquement Pseudomonas aeruginosa dont l'ADN semble se détériorer avec le temps mais on ne parvient pas à trouver un meilleur protocole d'extraction d'ADN.  [...] Je ne suis pas du tout spécialiste de l'extraction d'ADN bactérien mais ça m'étonne qu'une espèce particulière pose problème.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème : bande perdue avec QIAQUICK Gel Extraction Kit !

Le problème est qu'après cette purification, en suivant le protocole A LA LETTRE, je n'obiens que très très peu d'ADN (alors que sur le gel, j'avais de très jolies bandes bien voyantes), de l'ordre de 20ng/uL à peine, et une analyse spectro me donne un grand pic à 225nm environ.  [...] Pour cette étape, j'avais changé le tampon EB avec du TE pour tous les protocoles d'extraction et purification que j'ai. Et puis, souvent dans les protocoles Qiagen tu peux trouver un conseil d'attendre 1 min avant de centrifugier.  [...]

[Biologie Moléculaire] mutation génétique

la RT-PCR je l'ai refaite plusieurs fois et l'extraction aussi je pense pas que le problémes est au niveau technique. La technique de RT-PCR que j'utilise est la technique avec les hexaméres, j'utilise le kit d'invitogen le superscript III.  [...] Mon CDNA entier fait environ 6400pb. Trés bien pour l'info je n'exclue pas le défaut de la RT-PCR, je vais directement amplifier l'ADNg. Par contre qu'est ce qui peut expliquer l'instabilité de cet ARN et pas celle des autres patients cela peut être aléatoire cela serait-il lié à la mise en culture des fibroblastes avant l'extraction.  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction ADN Plasmodium

Je suis doctorant en parasitologie, une partie de mon travail repose sur la PCR de plasmodium. Le problème c'est que j'ai pas trouvé dans la bibliographie un protocole d'extraction d'ADN parasitaire depuis le sang total, j'ai trouvé seulement des méthodes utilisant des kit d'extraction tel que QUIgen.  [...] extraction de l'ADN totatal par l'un de ces deux protocole puis ensuite PCR avec des amorces spécifiques de Plasmodium, ca devrait faire l'affaire.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clone sans ADN

Lors de l'extraction d'ADN, (j'ai tenter le mini-prep maison et le kit mini-prep biobasic) je n'obiens aucun ADN lors de la migration sur gel d'agarose. J'ai répété l'expérience plusieurs fois, à partir du début, ma superviseur a testé également les clones et à chaque fois, il n'y a pas d'ADN.  [...] Vous avez fais une transformation des mêmes cellules avec un autre vecteur Vous avez réussi à le récupérer avec le même protocole d'extraction et les mêmes solutions.  [...]

[Génétique] PCR sur bactérie E.coli, recherche d'un kit pour son extraction

Je chercherai un fournisseur pour un kit d'extraction sur E.coli pour la PCR.  [...] Peut etre avez vous des suggestions à me faire... J'ai un budget très petit alors si vous connaissez un fournisseur qui pourrai me fournir ce kit en plus à un prix non excessif ce serai génial.  [...]