• Forum - Extraction, Plasmide, Code

[Biologie Moléculaire] Digestion du plasmide

l'autre jour j'ai pratiqué une extraction du plasmide pPLIP6 recombiné a l'insert qui code pour la protiene SAG1 et du plasmide pPICZ(b).  [...] simplement j'aurais besoin de comprendre les etapes de la digestion, les controles necessaires, les precautions à prendre aussi car jusque la c'est un peu flou pour moi.   [...]

[Biologie Moléculaire] Contamination d'ARN par de l'ADN

Le test que je suis en train de réaliser consiste à extraire les ARN totaux d'une souche et de rajouter à l'extraction une quantité de plasmide précise (je précise que je cherche les ARNm correspondant à la transcription de mon plasmide). Cette quantité de plasmide est soit DNasée soit non DNasée puis une PCR sera réalisée directement sur ARN (sans RT), cela me permettra de jauger l'efficacité de la DNase du moins je l'espère.  [...] Les essais ont révélés que la DNase du kit Machery Nagel ne fonctionnait pas assez sur colonne (amplification en PCR du plasmide ajouté pendant l'extraction d'ARN). Dans la notice de cette DNase il est précisé qu'en cas de grosse quantité d'ADN, il faut utiliser la DNase après colonne puis réaliser un clean up.  [...]

[Génétique] Gène inconnu

Tout ce que tu en tireras c'est qu'en transfectant la bactérie avec un plasmide contenant le gène d'intérêt pour peu que tu arrives à l'amplifier, le cloner etc. (et toutes ces manips ne sont pas gratuites, vas te falloir le matos pour le faire), tu observeras qu'elle pète aussi bien à 100° que sans le plasmide.  [...] En oubliant la thermostabilité, ne serait il pas plus simple de prendre une lignée de bactérie possédant un plasmide codant pour un quelconque rapporteur (résistance à un antibio, Lacz, Luc, etc...). C'est exactement le même projet, sauf que cette fois ci, il est réalisable.  [...]

[Microbiologie] Stabilisation d'un plasmide chez la levure

Concernant les prions, je ne savais pas. Moi je stockais juste mes levures à +4°C pour conserver des levures avec mes plasmides d'intérêt (lors des mes cribles doubles hybrides). Donc je relancais une culture liquide quand nécessaire, et je faisais une extraction de plasmide.  [...] Si c'est pour faire une extraction de plasmide derriere, je ne pense pas que ca pose de probleme. Maintenant si tu veux étudier la physiologie ou faire un crible en utilisant des cellules restées a 4°c la je le déconseillerai.  [...]

[Biologie Moléculaire] travaux pratiques, isolation plasmide

on utilise une enzyme de restriction Pst I 1ul et 0,75 ug DNA est ce que la quantite denzyme sufisante pour couper DNAsi non combien t a besoin pour couper cette quantite de DNAet pour combien de temps.   [...] 1 µL d'enzyme ça ne veut pas dire grand chose... Il faudrait connaître la concentration de PstI et elle est écrite sur le tube normalement. La concentration des enzymes de restriction est souvent de 10 ou 20 (parfois 50) U/µL. U est l'abréviation pour unité (d'enzyme) et par définition, une unité permet de digérer 1 µg d'ADN en 1 heure à 37°C et dans un volume final de 50 µL.   [...]

[Génétique] Plasmide

comment purifier le fragment linéaire apres amplification du plasmide pBR 322 dans escherichia coli et extraction de l'adn plasmidique.  [...] Lors de ta PCR t'as surement utilisé des amorces contenant des sites de restriction que tu dois utiliser donc voila tu commence par faire une digestion avec ces enzymes, tu dépose ensuite sur gel pour récuperer ton fragment, et ensuite tu purifie alors il existe plusieurs techniques de purfi pour des produits PCR recuperes à partir de gel.   [...]

extraction de gel

je dois faire une extraction d un plasmide qui a migre sur gel d agarose donc je dois faire une extraction sur gel est ce que auelau un peut il m expliquer le concept je dois utiliser le kit de biolabs de monarch.  [...] Le concept est tres simple dans ton tube ou tu récolte ton plasmide il peut y avoir plusieurs longueur d'ADN (ton plasmide avec insert, mais pourquoi pas ton plasmide vide, ou autre...) ducoup tu dois séléctionner uniquement ce qui t'interesse, tu les sépare donc par electrophorèse sur gel, et ensuite puisque tu visualise ou se trouve ton ADN sur ton gel, il suffit d'extraire (physiquement, avec une lame de rasoir par exemple)le petit carré ou se trouve la bande d'ADN qui t'interesse, ensuite le gel va etre fondu et purifié afin de retirer l'agarose et ne récupérer que l'ADN.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide dégradé

un bon résultat le jour de l'extraction mais par le suite le plasmide se dégrade.  [...] C'est assez difficile a dire, mais je crois pas en la magie, donc tu as surement une contamination nuclease quelque part. Regarde en changeant TOUTES tes solutions (chose que tu as faite apparement) ainsi que tes pipettes/cones.   [...]

[Biologie Moléculaire] Transfert de résistance

Si je prends une population de souches résistante, j'en ai à peut près la moitié qui présentent un plasmide a l'électrophorèse (après extraction avec un kit traditionnel). Et je veux savoir si la souche est capable de transférer son plasmide à une souche sensible et la rendre résistante.  [...] Je fais mon liquid mating, l'obtient des transconjugants résistants mais je ne retrouve pas forcément le plasmide... Premier problème. A ma connaissance, une bactérie ne peut transférer sa résistance que par le biais d'un plasmide, non Alors comment mes souches deviennent résistantes Estce qu'elle peuvent intégrer le plasmide aussi rapidement.  [...]

[Microbiologie] digestion d'un vecteur

je dois digérer mon plasmide p blue script (taille 3 kb ) avec Ecor I le produit d'extraction par miniprep se présente sur gel sous une forme surenroulée (1.5 kb) j'ai testé le tampon H seul sur le plasmide par incubation durant 1 h à 37 °c pour vérifier si oui ou non le tampon H est contaminé par des endonucléases sur gel j'ai obtenu deux bandes une à 1.  [...] 5 kb et l'autre à 3 kb or la miniprep ne m'a pas donné la bande à 3 kb s'agit il d'une digestion partielle le tampon est 'il contaminé je vous demande de m'aider s'il vous plaît.   [...]