• Forum - Expression, Protéine, Cellules

[Biologie Cellulaire] Etudier l'expression d'une protéine entre différentes cellules.

pour cela tu mets les cellules en culture puis à un certain temps tu prélève les cellules et tu fait l'extraction de la protéine et purification. lorsque tu fait le westerne blot tu révélera avec des anti-corps diriger contre la protéine d'intérer. sinon tu peux faire aussi un marquage de la protéine avec des acides aminées radioactive en utilisant la technique de pulse chasse.  [...] Merci de ta réponse, mais le Western blot ne permet pas (ou alors je ne voit pas comment) d'étudier l'expression dans UNE cellule.  [...]

Synonyme

Salut. Ubiquitaire signifie que la nicastrine est exprimée dans tous les types cellulaires, qu'on la retrouve dans tous les types cellulaires pratiquement. ( on parle aussi de gène de ménages ou housekeeping genes pour qualifier les gènes qui codent pour ces molécules ). Voilà j'espère que c'est assez clair.  [...] cela signifie que l'expression de cette proteine a lieue dans toutes les cellules de l'organisme. Il n'y a pas d'expression tissu specifique.  [...]

[Biologie Cellulaire] extraction protéique (ERK1/2) à partir de cellules U2OS

je suis un nouveau dans ce forum, j'ai un soucis, je voulais faire des culots cellulalires à partir des boites 35mm de cellules transfectées, la derniere fois javais pas beaucoup de prot en dosage lowri sachant bien que je gratte ma boite de cellules dans du PBS et je centrifuge 1000 RP 2min, après je lyse mes cellules dans du leamli 2X et je l'ai dose et ce que kelk'un pourrait me donner un protocol.  [...] j'ai une autre question differente je voulais peter un culot de cellules cultivées dans des boites 35mm j'utilise le grattage dans du PBS 1X la kestion à combien je centrifuge pour avoir un bon cult sachant que la derniere fois javais presque rien de materiel lors du dosage lowry.  [...]

[Biologie Moléculaire] Méthodes d'étude de l'ADN

Sur la seconde colonne, ce sont les protéines des cellules HelaAAVtCR-SC35GFP qui sont analysées. Ces cellules possède un virus AAV modifié et inactif (pour le moment) dans leur génome. De plus, une transfection stable a été réalisée pour ajouter la séquence codante (ADNc) de la protéine SC35GFP.  [...] Finalement, ces cellules doivent exprimé la protéine SC35 et la protéine SC35GFP (fluorescente, au cas où ). La GFP faisant 27kDa, la protéine SC35GFP doit donc faire environ 27+35=62kDa. Et l'on observe réellement une bande supplémentaire forte (car expression intense) et du même niveau environ que la protéine native, que l'on observe également à 35kDa.  [...]

[Biologie Moléculaire] Co-immunoprécipitation:?:

Ma protéine posséde une séquence IRES_GFP, ce qui fait que lorsque je transfecte mes cellules HEK je vois que la transfection a fonctionné puisque mes cellules sont fluo à 80%. Ce peut-il que le ribosome se fixe uniquement sur la séquence IRES et permette ainsi l'expression du GFP sans que la protéine en amont soir exprimée.  [...] bonjour, je comprends le but de la co-immunoprecipitation mais je n'arrive pas à comprendre comment intervient la proteine B. Pourriez vous m'indiqué un shéma clair sur un site ou m'expliquer l'apparition de cette 2eme proteine où est elle fixé.  [...]

influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

Oui, j'ai fait une analyse par Western Blot (2 anticorps, révélation électroluminescente). Je ne retrouve rien dans le surnageant, mais je retrouve la protéine dans la fraction soluble et non soluble après la lyse des cellules.  [...] 2 mg/ml, ça me semble déjà pas mal en cellules de mammifères. Peut-etre que tu as une proteine naturellement difficile à replier (protéine de plus de 40 à 50 kDa, beaucoup de ponts disulfures, peu de structures secondaires,... ) et que quelque soit le peptide signal que tu rajoutes, tu arriveras à une expression assez faible de toute façon.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de detection de ma protéine par immunofluorescence

j'ai fixé mes cellules avec du méthanol pur froid (-20°C) 48 heures apres la transfection 10 min, à 4°C. J'ai lavé avec du PBS, incubé avec mon anticorps anti-V5 (dilué au 1/200ème) 1h à 37°C, relavé avec du PBS et incubé 1h à 37°C avec mon anticorps anti IgG de souris couplé au FITC.  [...] J'ai une question un peu bête mais as-tu vérifié que ta protéine de fusion NS3-V5 est bien exprimée dans tes cellules après transfection avec un simple SDS-PAGE Je n'ai jamais fait d'expression en cellules eucaryotes mais je suppose que c'est un peu comme pour les bactéries.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème de culture cellulaire

En fait je dispose de 2 lignées de cellules (une WT et l'autre exprime une protéine X). Les 2 lignées poussent très bien dans les flasques. Par contre quand je les ensemence une des lignées pousse très mal contrairement à l'autre (elles ont du mal à s'adhérer et elles restent rondes alors qu'elles doivent etre étoilées).  [...] Bon ça manque de précisions mais d'après ce que tu nous dis je vais emmètre l'hypothèse que tes deux lignées sont bien sur a la base les même cellules (même origine, meme type...) et que leur seule différence est l'expression de ta proteine X. Si tes deux lignées pousse sur plastique (flasques) de la même façon et pas sur lamelle (que je soupçonne être en verre) (et toujours en admettant que ces deux lignées sont a la base identique a part pour ta proteine) je dirais qu'il est possible que de l'expression de ta proteine dépende celle d'integrine ou autre qui modifie les propriétés d'adhésion de tes cellule et ne leur permettent plus d'adhérer au verre.  [...]

[Biochimie] Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

J'ai besoin d'aide pour une question dans un exercice portant sur la construction d'un vecteur d'expression pour une proteine recombinante.  [...] On me demande de présenter les caractéristique generales de ce type de vecteur pour permettre son amplification dans le colibacille puis l'expression de notre proteine recombinante dans les cellules de souris.  [...]

[Génétique] Perte de la transformation d'une cellule cancéreuse.

Techniquement, la lignée a été congelée et décongelée peu de fois (2 à 3 fois maxi). Niveau repiquage j'étais à P6 (6 passages). On ne peut pas parler de lignée fraîche. Pourquoi le fait de décongeler ou repiquer aurait pu faire perdre l'expression de ma molécule à mes lignées.  [...] Oui c'est possible que si elle n'est pas très fraîche il y ait un perte de surexpression au profit d'autres protéines vitales.  [...]