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Mammalian Expression Vectors

J'aimerai savoir si quelqu'un pouvait me conseiller un vecteur d'expression pour mammifère dans le but de sur-exprimer un gène de façon stable dans des cellules humaines. Un vecteur non inductible et taggé à l'eGFP ou à la luciférase serait le top. En effet, il en existe un grand nombre sur le marché et je ne sais lequel choisir.  [...] J'ai cloné un cDNA humain d'un gène codant un facteur d'épissage alternatif dans un vecteur et je l'exprime en stable dans des cellules C2C12 (souris). Et bien mon taux d'expression de l'exogène est extrèmement faible par rapport à l'endogène de souris, et ça en ARN et prots.  [...]

[Biologie Moléculaire] Méthodes d'étude de l'ADN

Finalement, ces cellules doivent exprimé la protéine SC35 et la protéine SC35GFP (fluorescente, au cas où ). La GFP faisant 27kDa, la protéine SC35GFP doit donc faire environ 27+35=62kDa. Et l'on observe réellement une bande supplémentaire forte (car expression intense) et du même niveau environ que la protéine native, que l'on observe également à 35kDa.  [...] Le but de cette était de vérifier la production de SC35GFP, et surtout vérifier son poids moléculaire ainsi que la quantité relative vis-à-vis de la protéine SC35 native. On a donc put en conclure que la protéine SC35 n'est pas trop sur-exprimé (2-3 fois plus dans les cellules SC35GFP+) et que cette sur-expression est stable dans le temps.  [...]

[Biologie Cellulaire] La cellule mystère.... - Page 6

Ces MDCK sont une lignée stable pour l'actine GFP. Enfin relativement stable car les cellules du haut n'ont pas un niveau d'expression au-dessus du seuil de détection.  [...] En ce qui concerne le seconde image, il s'agit bien de cellules flagellées, mais d'un protiste. La question qui reste. à quoi correspondent les trois couleurs vert-bleu-rouge (Et si vous voulez parier sur l'organisme aussi).  [...]

short hairpin RNA

Je suis pas un specialiste des shRNAs mais apres une recherche rapide sur le net il semble que le mecanisme d'action soit identique aux siRNA. La difference est dans la structure secondaire de l arn. Le shRNA est un arn simple brin qui forme une tige boucle(comme tu peux voir ici.   [...] Les shRNA permettent une expression stable sur long terme des siRNAs dans les cellules.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression ectopique

j'ai besoin de votre aide afin de savoir comment réalise-t-on une expression ectopique sur un facteur de transcription dans le cadre d'une différenciation.  [...] On peut tout simplement transfecter un plasmide codant le facteur de transcription. Reste à savoir si l'expression du facteur de transcription doit être stable dans le temps. Si c'est le cas, alors il faut sélectionner les cellules ayant intégré le plasmide à leur génome. transfection stable.  [...]

[biologie moléculaire] Probleme expression apres transfection stable

J'ai réalisé une construction en vue de l'expression d'une protéine en stable par des cellules HeLa. Le vecteur utilisé est le pIREShyg3, qui comme son nom l'indique contient.  [...] La construction a bien marché, le séquençage est OK, les cellules transfectées résistent à l'hygromycine (pas les cellules non transfectées contrôle), mais pas de trace de notre protéine, rien. alors que l'expression est importante avec un vecteur pCMV en transitoire.  [...]

Différence RT_PCR semi-quantitative et Q-PCR

oui, je crois que son niveau d'expression change lors du cycle cellulaire, mais statistiquement sur le total de mes cellules il doit rester stable.  [...] 2 eme probleme avec 16S, si tu etudies l'expression de ton gene en differente condition de croissance, il y a fort a parier que la vitesse de croissance soit differente, ce qui fais que ton niveau de reponse style ppGpp dans la cellule est different, et donc [l'ARNr 16S] est differente entre tes echantillons.  [...]

[Biologie Cellulaire] voie de signalisation intracellulaire

Obtenir des lignée exprimant de manière stable l'inhibiteur ne pose pas de problèmes outre les problèmes classiques de transfection. Mais de toute façon on utiliserai juste une transfection transitoire pour ce type de manip donc les cellules perdraient vite l'expression de l'inhibiteur.  [...] Les inhibiteurs surexprimés par un promoteur type Gal ça existe aussi mais faire entrer la protéine, je sais pas si sa existe car il faudrait une quantité de protéine purifié importante et faire entrer tout sa dans chaque cellule.  [...]

[Biologie Cellulaire] Transfection et nombre d'intégration

Voilà je me pose la question suivante. je sais que cela dépend de la méthode de transfection, de la lignée cellulaire et du plasmide, mais prenons des éléments courants. une lignée HeLa, transfection lipofectamine, avez-vous une idée après sélection antibiotique du nombre de copies plasmidiques qui s'intègrent en moyenne dans le génome d'une cellule.  [...] Une deuxième question liée à la première. pour établir une lignée stable, compte-tenu du fait que l'on sélectionne un évènement rare, la méthode la plus pratiquée est-elle la sélection et amplification puis vérification individuelle de clones (c'est ce qui me semble le plus approprié) ou bien des gens poolent -ils leur cellules après sélection bien que celles-ci puissent avoir perdu le gène d'expression ou en posséder différents nombres de copies.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transduction/transfection

Bonjour, je suis à la recherche de connaisseurs en terme de transfection et transduction. J'ai des notions pour la transfection (utilisant des retrovirus pour infecter des cellules afin d'exprimer de façon stable un gène) et la transduction (utilisant des virus, cosmides) pour une expression temporaire.  [...] Salut Fxmulder, merci pour ton avis... Qu'est-ce que tu entends par utiliser un vecteur viral est plus rapide/mons aléatoire que d'utiliser un agent transfectant Pourtant, tous les kits lipofectamine et autres utilisent ce genre de matériel pour avoir des transfections quellles que soientt les cellules en face, non D'ailleurs les cultures cellulaires que j'ai (expression permanente d'un canal) sont stables et ont été faites avec justement la lipofectamine.  [...]