• Forum - Expression, Bactérie, Intérêt

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

- L'insert est toxique pour la bactérie. Dans ce cas il faut utiliser une souche réprimant l'expression du gène d'intérêt, par exemple XL1blue.  [...] @flyingbike. mon expérience perso c'est que la ligation proprement dite est rarement le problème. Quasiment tous les problèmes de ligation que j'ai vu sont en fait des problèmes de restriction ou de transformation (bactéries pas suffisamment compétentes).  [...]

[Biologie Moléculaire] activité des protéines recombinantes

Je me demande si les protéines recombinantes fusionnées à la GST peuvent être active dans les cellules. D'autre part, est-ce qu'il est possible de couper la fusion GST de ces protéines.   [...] 2) Oui, il suffit d'insérer un site de clivage entre la GST et la protéine d'intérêt. Il existe des vecteurs contenant déjà ce site de clivage en amont du MCS, par exemple le Pgex6P1 pour l'expression en bactéries.  [...]

[Biologie Moléculaire] Gros problème.....

je suis sensée créer un vecteur d'expression (Kit Qiagen pcDNA 3.1 TOPO isomerase) à partir de clones bactériens contenant notre protéine d'interet.  [...] mais la quantité d'adn ne semble pas etre un probleme sauf à grande dose car le PCR marche avec l'utre protocole d'extraction (typa maxiprep) et sur la suspension bactérienne.  [...]

[Génétique] Différents bactérie pour exprimer une protéines , plusieurs vecteurs d'expression

[Génétique] Différents bactérie pour exprimer une protéines, plusieurs vecteurs d'expression.  [...] Je voulais savoir pourquoi il existe de nombreuses bactéries pour exprimer une protéine et pourquoi il existe autant de vecteurs d'expression.  [...]

Technique Gateway

je n'étais pas sur d'avoir compris l'interet des 2 vecteurs et 2 recombinaisons pour cette technologie, je me demandais pourquoi ne pas utiliser directement le vecteur d'entrée comme vecteur d'expression.  [...] je pense que l'interet du vecteur donneur (qui devient vecteur d entrée après avoir récupéré le gène) est qu'il a tout les gènes permettant l'infection lambda et les gènes accompagnateurs de la recombinaison. Et le vecteur de destination (qui devient d'expression) a les gènes permettant la suexpression du gène d'intéret (promoteur inductible ou costitutif,...).  [...]

[Biologie Cellulaire] Synchronisation cellulaire

je voudrais savoir quel etait l'interet de comparer un paramètre tel que la variation de l'expression d une prot dans le temps, entre une population synchronisée et une population cellulaire asynchrone en dehors de definir le taux d'expression dans une phase donnée, apres je ne vois pas.  [...] Suite à ta précision, je pense que l'interet de synchroniser une population ou un ensemble de population, c'est pour les comparer entre eux, et au dela d'un calcul de taux d'expression, c'est de voir aussi si temporellement ou localement il n'y aurait pas un facteur influençant une quelconque activité, surtout quand on parle de cycle cellulaire.  [...]

GFP et mcherry

1) Si je comprends bien on utilise les gènes qui codent pour la GFP et la mcherry, qui seront insérés (liés au promoteur) dans un transgène, quand ceux ci seront traduits en protéines il y aura fluorescence et donc on pourra détecter si il y a eu expression de notre gène d'intérêt.. Ai je bien compris.  [...] Pas vraiment.. il s'agit juste de révéler l'expression d'un gène... Pour cela on introduit par agroinfiltration plusieurs types de plasmides soit avec le gène d'intérêt sur exprimé ou pas, à ce gène est couplé la GFP et la mcherry (d'ailleurs je ne sais même pas où l'on place la mcherry) c'est pour ça que je ne vois pas son intérêt.  [...]

[Biologie Cellulaire] Vecteur d’expression dans une bactérie

[Biologie Cellulaire] Vecteur d'expression dans une bactérie.  [...] -Je voudrai savoir si lorsque l'on introduit un vecteur contenant l'adnc d'une protéine eucaryote dans une bactérie on est obligé de mettre une queux poly T sachant que les Arn procaryote non pas de queux poly A.  [...]

Stratégies d'insertion de fusions de gènes

2. Inconvénient. on ne sait pas où la contruction s'intègre, elle peut donc être insérée au coeur d'une séquence essentielle à la régulation du gène d'intérêt et donc l'activité du gène rapporteur peut ne plus refléter strictement le niveau d'expression du gène d'intérêt.  [...] Moi, ici, je suis plutôt dans une démarche de fusion de gènes (fusion traductionnelle) ou d'opérons (fusions transcriptionnelle) entre gène d'intérêt et gène rapporteur, de façon à étudier le type de régulations transcriptionnelles et post-transcriptionnelles qui contrôlent son niveau d'expression, ce dans différentes conditions (ex.  [...]

Gène de ménage (gène de référence...)

Le Ct(gène d'intérêt) est donc le cycle où commence la phase exponentielle pour ton gène d'intérêt. Le Ct(contrôle) est le cycle où commence la phase exponentielle pour un gène de référence(dans le même tissu.), le fameux gène de ménage dont l'expression ne varie (quasiment) pas.  [...] Ensuite, tu peux comparer ton Delta CT entre plusieurs tissus différents (ou bien plusieurs conditions...) et ainsi mettre en évidence des variations dans l'expression de ton gène d'intérêt, toujours par rapport au gène de référence, qui théoriquement ne doit pas bouger.  [...]