• Forum - Excès, Anticorps, Conditions

[Biologie Cellulaire] Co-Immunoprécipitation

on fait une électrophorèse en conditions dénaturantes (et là j'ai écrit excès d'anticorps je sais pas pourquoi. C'est quoi des conditions dénaturantes pour un complexe protéines-anticorps ).  [...] 6. Tu déposes sur gel et fait un Western Blot. Tu révèles avec un anticorps dirigé contre ta protéine B (alors que l'IP a été faite avec un anticorps contre la protéine A). Si tu as une bande au poids attendu pour B, cela signifie que tu as co immunoprécipité B avec A.  [...]

[Biochimie] Le complement

Alors tous ce que je sais du dosage de l'activité complémentaire globale c'est que tous les titrages utilisent le phénomène de l'hémolyse. On se sert habituellement d'une quantité déterminée et précise de globules rouges de mouton sensibilisés par un excès d'anticorps et dans des conditions expérimentales rigoureusement fixées.  [...] Il faut aussi savoir que la valeur normale du taux de complément sérique ne peut être définie qu'en fonction des conditions de dosage utilisées pour la réaction. des modifications du temps ou de la température d'incubation, des variations du volume réactif total ou de la concentration globulaire de la suspension d'hématies employée font varier les résultats.  [...]

[Biologie Cellulaire] Marquage par Ac-FITC : du solide ?

Après la période d'incubation, j'aurais ajouté un anticorps anti-[protéine récherchée]. puis un second anticorps marqué au FITC et dirigé contre l'anticorps du complexe précédent.  [...] Lors d'une assistance à une thèse sur le biofilm marqué au FITC, on ne faisait que 3 lavages consécutives après 2h d'incubation et 22h d'incubation, lavage au PBS, donc je ne vois pas le problème si tu souhaite éliminer l'excès d'anticorps par ce moyen (enfin on utilisais des lectines nous, pas des anticorps ^^).  [...]

Effet hook

Je fais actuellement un stage et travaille à la caractérisation d'anticorps. En faisant des graphiques sur base de résultats de tests Elisa, j'ai remarqué que dans certains cas, il y avait une courbe qui monte, puis descend. On m'a dit qu'il s'agissait de l'effet hook, mais personne n'a su m'expliquer cet effet.  [...] On parle d'effet hook dans certains cas d'ELISA sandwich (en 1 etape). Lorsque tes Anticorps secondaires ne sont plus en exces par rapport a ton Antigene (Donc le probleme provient de l'Antigene et non de l'Anticorps). En d'autre termes tes Anticorps reactifs vont se lier au complexes Ac capteurs-Ag, mais egalement aux Ag libres (vu que l'Ag est en exces).  [...]

[Biologie Moléculaire] Methode sandwich ACTH

le dosage radioimmunologique de l'ACTH est classiquement réalisé selon la méthode sandwich du kit ELSA-ACTH où le premier anticorps monoclonal en excès est adsorbé sur une phase solide. décrivez en détail cette méthode.  [...] Bonjour, Elisa sandwich est une méthode qui permet la détection d'antigènes par des anticorps monoclonaux. tout d'abords il ya fixation d'Ac sur un support solide, puis on ajoute l'échantillon, s'il contient l'antigène, il sera fixé spécifiquement par les Ac, on fait un lavage pour éliminer l'excès, et on ajoute un 2ème Ac spécifique de l'antigène et qui est couplé à une enzyme.  [...]

[Biologie Cellulaire] monocyte et immunofluorescence

et on utilisait des cellules adhérentes, ce qui permettait de faire des lavages (excès d' anticorps).  [...] Pour les cellules non adhérentes, on utilise la méthode du cytospin qui consiste à centrifuger les cellules avec au fond une lamelle. On centrifuge à 7000g environ pendant 10 minutes, avec la force centrifuge les cellules se plaquent sur la lamelle, on peut ainsi fixer ces cellules au paraformaldehyde puis réaliser les étapes suivantes d'une immunofluorescence.   [...]

[Biochimie] Détection au cytométre de Flux

Mon problème se situe au niveau des résultats obtenus. J'utilise un anticorps couplé à du PE et les cellules sont perméabilisée à la saponine car le CMH de classe I que je souhaite détécté à été rendu soluble. Je commence donc par passer mon témoin négatif (cellules perméabilisées non transfectées + Ac-PE), j'obtiens un pic normal.  [...] Le décalage des témoins me paraissait trop important pour être seulement du à la transfection. D'après ce qu'on a pu me dire, ce décalage serait en fait du aux anticorps qui se fixent de manière non spécifique à des récepteurs Fc. Ce qui induirait une fluorescence supplémentaire.  [...]

[Immunologie] test Elisa

Par exemple, tu peux pré-incuber ta protéine d'interet avec son anticorps (tu la neutralise en quelque sorte) pour ensuite déposer ce mélange sur ta plaque avec l'anticorps coaté au fond du puits. Ainsi tu vérifies que tu as bien un résultat négatif et que ton anticorps est bien spécifique de ta protéine.  [...] - dans le puits HBs Bk, l'HBs de l'échantillon va majoritairement (voire totalement) se fixer au Ac de ta solution de neutralisation et non pas sur les billes. L'Ac complémentaire couplé PhA se fixe au complexe Ac/HBs soluble mais pas (ou peu) aux billes. Le champs magnétique permet de ne conserver que les billes magnétiques et d'éliminer les complexes solubles.   [...]

[Biologie Moléculaire] Principe des banque génomique/cDNA

D'abord, commence par dire quel est le but de l'expérience. Et non pas comme tu le fais ici. en conclusion, il a reconstitué le gène de l'albumine.   [...] Ce qui explique pourquoi cette histoire de chance n'a pas trop de sens ici (sauf si l'on ne travaille pas dans ces conditions d'excès).  [...]

[Biologie Cellulaire] Plasmide eucaryote/bactérien dans une lignée cellulaire

Pas besoin de sélectionner si c'est du transitoire, en revanche il faut s'assurer que les meilleures conditions ont été choisies pour voir une expression, tu transfectes les cellules auquel cas, il faut tester plusieurs conditions de transfections, différentes quantités de vecteurs avec différentes quantités en excès de lipofectamine ou autre transfectant, car tu es peut-être dans des conditions ou tu ne transfectes pas beaucoup, puis tester l'expression à 24h et 48h post-transfection comme l'a proposé Yoyo.  [...] J'utilise des HEK-293 et mes conditions de transformations pour cette souche sont optimales (~ 90% de cellules transformées). J'ai déjà transformée cette lignée avec d'autres plasmides qui ont bien exprimés leur gène donc je doute que ça soit la transformation qui pose problème.  [...]