• Forum - éthanol, Tampon, Protéines

[Identification] IPG strip gel combiner a une extraction au PBS

L'extraction classique utilise un tampon phosphate pour le broyage initial, je doute que cela soit ca du fait des lavages, ensuite les proteines sont precipites avec du TCA, laver avec de l'ethanol et remis en solution avec un tampon dont je n'ai pas la composition sous le coude (je suis en stage donc je ne connais pas encore toute les solutions exactement).  [...] Vour pourriez peut être tenter également un coloration au nitrate d'argent qui est bien plus sensible que le bleu de Coomassie afin de voir s'il n'y a pas de spot du tout ou si la concentration en protéines est seulement juste un peu faible.  [...]

[Biologie Moléculaire] Purification methioninase

A part ça, on ajoute souvent 1 mM de DTT ou de mercapto-éthanol dans le tampon de nos protéines pour éviter qu'elles ne s'oxydent trop rapidement. Et quand je purifie une protéase, je rajoute aussi 10% v/v de glycérol pour la stabiliser.  [...] Après clivage, tu vas pousser avec du tampon et ta méthioninase va partir en même temps que ta protéase. Il faut en fait utiliser une deuxième colonne que tu fixes à la suite et qui va te permettre de fixer une des deux protéines. C'est à toi de voir ce qui est le mieux comme colonne pour éviter que les deux se fixent (échangeuse d'anions, de cations...).  [...]

[Génétique] Extraction d'ADN plasmidique de bactéries

été contaminée par des protéines et je me demandais avec quelles étapes de mon protocole cela a t'il pu arriver et pourquoi.  [...] J'ai la présence de composés aromatiques et de très peu d'éthanol dans ma solution, mais je me demande comment j'ai pu contaminer ma solution, est ce du au tampon que j'ai utilisé pour solubiliser et dénaturer les protéines.  [...]

Isolat de protéines

Tu précipites ensuite les protéines à l'éthanol à 95% mais le problème est que sa dénature. Ce qui peut être plus adapté est de faire passer le lysat sur une colonne DEAE-Dextran, et ajouter une étape de traitement RNase/DNase. Mais pour ce qui est de la purification, beaucoup de méthodes peuvent être possible, à chacun ses techniques de prédilection.  [...] Tu broit dans un tampon avec si possible un inhibiteur de protéase. Tu récupère le surnageant, et puis ensuite l'extraction de protéines classique, avec un détergent doux de type Tween (80, 20). Tu précipites ensuite les protéines à l'éthanol à 95% mais le problème est que sa dénature.  [...]

[Divers] Contenu "Matériels et méthodes" - rapport stage M1

Les extraits protéiques sont dénaturés à 95°C pendant 5 minutes en présence de LSB 1X final avant d'être déposés sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 6%. Les immunoprécipitations sont dénaturées à 95°C pendant 5 minutes dans 25 µl de LSB 2,5X. Après migration électrophorétique, les protéines sont transférées en milieu liquide sur une membrane de nitrocellulose (HybondTM C Extra, Amersham Bioscience) pendant 1h30 dans un tampon de transfert (50 mM Tris base, 40 mM Glycine, 1,3 mM SDS et 10% éthanol).  [...] Après plusieurs lavages, les protéines d'intérêt sont révélées par chimioluminescence (Kit ECL+, Perbio) et détectées par une caméra CCD.  [...]

[Biochimie] Questions Coomassie et Western Blot

Une question quant au rôle du méthanol dans les solutions de staining/destaining pour les Coomassie Il limite la diffusion des protéines.  [...] Le méthanol et l'éthanol rendent le gel plus poreux, ce qui permet de faciliter les échanges avec le tampon (que ce soit de transfert ou de staining en coomassie). Cela permet une meilleure pénétration du coomassie dans le gel pour colorer les protéines, et cela facilite la sortie des protéines du gel pour le transfert.  [...]

[Biologie Moléculaire] l'extraction d'ADN

Ethanol. l'ADN est insoluble dans l'éthanol 70% ou 100%, son but sera d'éliminer les contaminants (du genre protéines, lipides...) tout en laissant l'ADN intact.  [...] Tampon de lyse. contient ce qui va lyser la cellule. Il contient souvent des protéases (clivent les protéines des parois) et des détergents (dissolvent les membranes). Cela permet de libérer tout le contenu cellulaire.  [...]

recherche d'un contact par mail avec un laborantin

Pour résumer. détruire les cellules (qui ont été lavées dans un tampon) à l'aide d'un détergeant (SDS trouvable dans le commerce), faire une première centrifugation courte pour faire descendre tout les débris cellulaires, prélever le surnageant (où il y a l'ADN et des protéines), puis faire précipiter l'ADN à l'aide d'Ethanol et d'acetate de sodium.  [...] Pour l'éthanol, au labo, on en a deux sortes. L'éthanol 100% classique (en fait 99%), que l'on utilise pour les tampons etc... Et l'éthanol ultra pure (99,999% certifié) pour les manips les plus précieuses (précipitation de l'ADN par exemple). Et je confirme que le méthanol est de moins en moins utilisé, à cause des coups de son élimination (toxique, donc pas dans l'évier.).  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression hétérologue de protéine : vecteur baculoviral

J'imagine que tu fais une coloration de gel à l'argent pour voir ta protéine. Parfois on ne voit pas la bande. Ca ne veut pas dire que la protéine n'est pas exprimée. Comme ta protéine est tagguée tu peux faire un westernblot en dénaturant les protéines au bête beta mercaptoethanol. Normalement cela rompt les ponts.  [...] Sinon nous au labo on met 1mM de mercapto-éthanol ou de DTT dans nos tampons pour éviter un minimum l'oxydation des protéines.  [...]

[Biologie Moléculaire] échec de révélation sur gel d'agarose des produits d'ADN après purification

normalement, avant d'éluer (EB ou H2O) la colonne est centrifugée pour faire passer le tampon de lavage puis recentrifugée a vide. Normalement plus un poil d'ethanol.  [...] Normalement on lave avec un tampon qui doit contenir de l'éthanol mais l'ADN reste encore sur la silice de la colonne. On centrifuge pour éliminer l'éthanol et on recentrifuge la silice à vide pour finir de sécher (l'éthanol peut sinon faire des interférences lors du traitement de l'ADN pour le dosage ou la migration) On dépose ensuite de l'eau stérile ou alors un tampon d'élution sur la silice de la colonne(perso je préfère l'eau).  [...]