• Forum - étape, Chauffage, ADN

[Biologie Moléculaire] Utilisation de la résine Chelex pour reverse crosslink de l'adn

Je l'utilise dans le cadre d'immunoprécipitation de la chromatine, j'en ajoute 100 uL à 10% sur mes échantillons immunoprécipités pour détacher les complexes protéine/anticorps/billes de l'adn. Pour cela je mets le tout à 99°C pendant 10 minutes.  [...] Le Chelex est un chelateur puissant. Il va chelater les ions positifs ce qui va permettre d'eviter la degradation de l'ADN lors de l'etape 99 deg C / 10min. C'est cette etape de chauffage qui va dissocier les proteines de l'ADN. Chelater les ions va aussi inhiber les DNases.  [...]

[Génétique] les différentes étapes pour une PCR

Avant de commencer ta PCR, ton ADN est souvent en pelote. cette étape de chauffage va servir à bien dénaturer tous tes doubles brins. Elle dure 10 minutes pour etre sûr que tous tes brins vont se séparer.L'amplification va ensuite pouvoir commencer sans problème.  [...] Ceci est valable pour l'ADN génomique. Pour un plasmide, 2 min suffisent largement. Pour l'ADN génomique, je préfère chauffer une fois pour toute à 95° pendant 10min, puis mettre sur glace (important pour que les 2 brins ne se ré apparient pas totalement).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème après digestion/Klenow/dénaturation

J'ai du coup regardé à chaque étape (car notons que je faisais en parallèle exactement la même chose sur un autre vecteur qui contient mon insert et là ça a marché), et il s'avère que c'est la dernière étape de chauffage qui est fatale à mon ADN.  [...] Oui j'ai laissé redescendre la température, peut-être pas assez (.) (en mm tps ça fait maintenant 3 fois que j'ai le résultat, donc c'est reproductible.) et je ne pense pas avoir de problème avec le peigne car avec mon test sur un aliquot à chacune des étapes de la manip, j'ai une belle bande correspondant à la taille du vecteur pour chacune des étapes, sauf pour le puit correspondant à cette dernière étape de chauffage.  [...]

[Biologie Moléculaire] éléctrophorèse d'1 seul brin d'ADN?

On me demande de décrire la procédure pour obtenir une empreinte de chacun des brins (non codant et codant).   [...] Comment faire J'ai du mal a savoir l'ordre des étapes a faire... Je pense qu'il y a un marquage de l'ADN puis séparartion des brin par chauffage... Peut etre qu'après on utilise des amorces aussi.. mais comment isoler le brin codant du non codant.  [...]

[Biochimie] Activité enzymatique

Ca me rassure si les protéines ne précipite pas dans du sérum physiologique, c'est déja une très bon point à vrai dire. Par contre il est quasiment impossible de solubiliser le culot et même de le pipetter(c'est de l'amidon bien pateux style maizena en plus compacte) a moins de chauffer fortement, ce qui a mon avis va alterer l'activité enzymatique.  [...] En plus, vous pouvez utiliser le chauffage pour solubiliser le culot sans soucis puisqu'une étape de chauffage est nécessaire pour incorporer le colorant entre les protéines.  [...]

[Biologie Cellulaire] Anticorps WB ou ICC

En effet, j'ai un anticorps primaire (cadeau d'un autre labo) qui fonctionne en ICC mais quand j'ai voulu faire un WB, je n'avais aucun signal spécifique... Après un petit coup de bibliographie, ils'est avéré que cet Ac n'avait jamais été utilisé lors des WB, et même dans une publi où il était utilisé pour de l'ICC, l'équipe avait utilisé un Ac commercial dirigé contre les mêmes aa de la protéine cible pour faire le WB.   [...] Si je supprime l'étape chauffage, serait-il possible de ne plus avoir ce problème Et le bétamercapto dans le laemmli.  [...]

[Génétique] PCR, marqueur biologique

1. Dénaturation REVERSIBLE de l'ADN par chauffage pour séparer les deux brins -. 95°C.  [...] 3. Extension des amorces de 5'-. 3' via une ADN polymérase thermostable, ce qui permet de synthétiser un nouveau brin d'ADN artificiel qui sera strictement complémentaire du brin qui a servi de matrice -. 72°C.  [...]

pourquoi les protéines dénaturée sont dégradées

Edit. par contre, la dénaturation par chauffage n'est pas nécessairement irréversible, même dans le cas de rupture de liaisons faibles. quand tu dénatures l'ADNdb en ADN mono-brin par chauffage et que tu le refroidis, l'ADN reprend une conformation en double-brin (plus ou moins spécifiquement).  [...] Je donnais simplement un contre-exemple montrant que la dénaturation par chauffage n'était pas nécessairement irréversible dans le domaine biologique, histoire d'éviter d'avoir le réflexe. Ah, chauffage de machin chouette -. Du coup, c'est irréversible.  [...]

[Divers] Intérêts du NaDOC, SS DNA, chelex, Tris Cl dans plusieurs expériences

Je ne connais pas suffisement les protocoles que vous utilisez, cependant l'utilisation de Tris Cl sert milieu tampon. Il permet de conserver un ph régulier durant toutes vos expériences. Ainsi, travaillant avec de l'adn et des protéines, tous deux très semsibles aux changements de ph, vous évitez des dénaturations.  [...] Après lecture de certains sites, le chélex lie les ions nécessaires à l'action des nucléases, ce qui protégé l'ADN pendant le chauffage à 99°C effectué lors du reverse crosslink.  [...]

[Génétique] Principe de l'extraction d'ARN???

J'ai vainement essayer de trouver une réponse à ma question en faisant partant de la piste donnée par Tiscarab... Mais rien de très concluant, la seule chose précisée dans le protocole est que la méthode combine les propriétés de fixation sélective des membranes de silice et de multiples étapes de centrifugation... Ca ne m'aide pas vraiment.  [...] Pour isoler l'ARN il faut le retenir. et eliminer les protéine par dénaturation ( chauffage) et eliminer l'ADN par DNase).  [...]