• Forum - Enzymes, Restrictions, Extrémités

[Biologie Moléculaire] Comment séquencer un génome inconnu ?

J'ai pensé pour séquencer d'extraire l'ADN de l'organisme puis de digérer celui-ci avec des enzymes de restrictions. J'obtiens ainsi différents fragments dont les quelques nucléotides aux extrémités sont connus grâce aux sites de restrictions. Est-il possible alors d'y hybrider de façon spécifiques des sondes pour permettre un séquençage avec la méthode de Sanger par exemple (car les sondes sont plutôt longue par rapport aux sites de restriction non ).  [...] De nos jours, on ferait du séquençage haut débit. fragmentation de l'ADN et ajout d'adaptateurs connus aux extrémités pour faire en parallèle des millions de reads qui peuvent être alignés entre eux par chevauchement (contigs).  [...]

[Génétique] Construire un vecteur de transgenèse dérivé des transposons

Pour ce faire nous allons réaliser une PCR du gène Tet avec deux amorces contenant des sites de reconnaissances pour les enzymes de restriction XbaI et HindIII. Visiblement les amplicons obtenus possèdent à chaques extrémités le site de reconnaissance pour ces enzymes de restrictions et une Adénosine (d'ailleurs là j'ai pas compris d'où elle vient).  [...] 3-On introduit les enzymes de restrictions XbaI et HindIII. on va avoir le fragment Tet qu'on va ensuite insérer dans pBCKs+.  [...]

[Biologie Moléculaire] clonage directionnel

soit un clonage directionnel d'un insert dans un plasmide vecteur, c'est quand l'adn contenant l'insert et l'adn vecteur sont tout les deux digérés par les mêmes enzymes de restriction, et donc le clonage se fait par appariement d'extrémités cohésives, c'est ça.  [...] Le clonage directionnel est un clonage dans lequel le fragment cloné ne peut se cloner que dans un sens (en effet grace a des enzymes de restrictions qui forment des extremités incompatibles). Le clonage non orienté est un clonage dans lequel le fragment peut s'insérer dans les deux sens.  [...]

[Biologie Moléculaire] Projet de clonage

comme controle de lexpression in vitro (dans 3T3 cellules) il faut construire le suivant. clonez le gfp gen dans le plasmide pcDNA3.1 apres le CMV promoteur. c est un promoteur virale qui est actif dans toutes les cellules eukaryotes. controlez avec les enzymes de restrictions le nouveau plasmide. pcDNA3.1-GFP.  [...] pour commencer tu dois digérer ton vecteur pCDNA et le gene GFP avec une ou deux enzymes de restrictions identiques pour que les extrêmités soient cohésives. Tu connais les cartes de resctriction de tes vecteurs.  [...]

[Biotechnologie] Vecteur d'expression et enzymes de restriction

On utilise des enzymes de restrictions pour isoler le gène d'intérêt, son promoteur, etc... et en parallèle on a recours à d'autres enzymes de restriction pour couper le vecteur.  [...] De manière général tout est inclut dans le vecteur. promoteur, terminateur, eventuels tag et MCS (sites de restriction) Il ne reste qu'à cloner l'ORF du gène qui vous interesse. Que vous aurez extrait avec des enzymes de restrictions et en parallèles vous ouvrirez le vecteur à l'aide des mêmes enzymes de restriction au niveau du MCS afin de générer des extrémitée compatible.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage par PCR taille des amorces

En général les oligos font 20-30pb et on essaye d'avoir un ratio équilibré entre les G+C et les A+T (dans ces conditions, une PCR aux température d'hybdridation classiques 51-58°C doit fonctionner). La restriction coupe ton ADN proprement, pas besoin d'ajouter des bases pour protéger ta séquence codante.  [...] En revanche on conseille de rajouter quelques bases entre le le site et l'extrémité 5' de façon à internaliser le site car les enzymes de restrictions sont des ENDOnucléases, il faut que leur cible soit au milieu.  [...]

[Biochimie] Petite interrogation sur les enzymes de restrictions

Il y aurait à priori une différence du nombres d'enzymes de restriction utilisé dans le PCR pour multiplier l'ADN. Celui de la France serait différent de celui des Etats-Unis par exemple.  [...] Excuse moi si je n'est pas utilisé le bon terme, j'ai écris ce message un peu rapidement, c'est vrai que c'est LA PCR et, vous avez raison, il n'y a pas d'enzyme de restriction mais ce sont les enzymes polymérase dont je parlais (ou TAQ polymérase). Voilà après cette correction pouvez vous répondre à ma question précedemment posé.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment choisir les enzymes de restrictions pour un clonage?

Je suis étudiante en L3 de bio. J'ai un exercice de biologie moléculaire à faire et je bloque sur le choix des enzymes de restriction.  [...] J'ai joins le fichier de mon exercice. Comment choisir les bonnes enzymes Doivent-elles être présentes sur le MCS du plasmide et absentes de l'adn du STAT5B.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage - Page 2

donc l'objectif etait de faire une amorce sens a gauche en inserant un site de restriction une amorce qui est vers le MCS mais là elle permet d'apporter 2 sites de restrictions et de l'autre coté faire une amorce sens a droite en inserant un site unique (les deux inserts ont donc a leurs extremités un site unie et au milieu au refait un MCS) et de meme son amorce complémentaire est vers le MCS et permet d'inserer 2 nouveaux sites de restrictions.  [...] je suis bien d'accord, mais ces sites vont etre au niveau des morceaux de genes aux extremités que je ne veux pas donc certes apres restrictions ils seront amputés et donc pas fonctionnel mais il y aura toujours des morceaux donc c'est pas très propre, les deux sites uniques que j'ai mis juste pour cadrer la sequences que je veux ont ce role, d'eviter d'avoir les parties aux exterieurs.  [...]

[Biologie Moléculaire] activite enzymes de restrictions

bonjour j'ai besoin d'aide s'il vous plait pour un exercice sur l'activité des enzymes de restrictions.  [...] 2) si l'on veut générer des fragments de 1000pb lors des 2 digestions indépendantes par ces enzymes, expliquer quel est le pourcentage d'ADN que l'on doit couper.  [...]