• Forum - Enzymes, Restriction, Vecteur

[Biotechnologie] Vecteur d'expression et enzymes de restriction

Je ne suis pas certaine d'avoir bien compris le recours aux enzymes de restriction dans la construction d'un vecteur.  [...] On commence par insérer le promoteur qu'on lie au vecteur grâce à une ligase (en supposant bien sûr que les deux extrémités soient compatibles), puis on insère le gène qu'on lie au promoteur et enfin on fait de même avec le terminateur.  [...]

[Biologie Moléculaire] ligation

Par exemple, lorsque tu fais ta digestion, il est conseillé de faire des témoins négatifs (sans enzymes de restrictions), des témoins positifs (lors d'une double digestion, tu vas faire deux témoins de simple digestion), puis tu vas faire migrer le tout (ton produit de digestion, tes trois témoins) sur des gels d'agarose.  [...] - Soit on clive le vecteur avec deux enzymes de restriction différentes qui génèrent des bouts collants incompatibles. L'insert est clivé avec les même enzymes. Cette méthode a l'avantage d'empêcher la recircularisation du vecteur et favoriser une insertion orientée de l'insert dans le vecteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Promoteur banque BAC

J'aimerai globalement connaitre la démarche pour récupérer une séquence promotrice d'une banque BAC pour ensuite le cloner dans un vecteur rapporteur et étudier ce promoteur.  [...] Après la PCR, tu clives l'insert avec la ou les enzymes de restriction appropriées, idem pour le vecteur. Puis ligation insert/vecteur.  [...]

[Biochimie] Clonage vecteur navette sur la levure

-Digérer l'Insert et le vecteur par les enzymes de restriction.. ok.  [...] En fait, le passage en bactérie te sert à amplifier la quantité de plasmides, pour être certain que, lors de ta transformation, de l'ADN entrera effectivement dans la cellule.   [...]

[Biologie Moléculaire] pcr sur colonies clonage

Quand je clone, je crible mes clones sur colonies et je ne séquence que 2 ou 3 clones qui sont positifs en PCR. D'ailleurs j'utilise toujours une amorce dans l'insert, l'autre dans le vecteur pour être sûr de la nature de mon vecteur, de mon insert, de la taille de mon insert et de sa position dans le vecteur.  [...] Et oui, toujours séquencer à chaque étape, ça évite de se retrouver en fin de travail avec un vecteur dont l'insert porterait une mutation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

est-ce que je dois essayer de trouver les sites de restriction des enzymes des vecteurs dans la sequences du ARNm et choisir le vecteur qui contient le plus d'enzymes dont les sites de restriction on ete trouve dans l'ARNm.  [...] 2-Les sites de restriction doivent être localisé sur un marqueur de séléction. Donc si je prends comme exemple le vecteur pBR322, je peux utuliser les enzymes de restriction marquees sur la carte du vecteur, qui sont dans ce cas. PvuII, Sty I, BstZ I, Sal I, Sph I, BamH I, EcoR V, Hind III, EcoR I, Sca I, PvuI, PstI.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Dans tes colonies vecteur+insert il y en aura forcément sans insert (à verifier par PCR ) Si ton vecteur a été digéré par 2 enzymes de restriction différentes, il ne pourra pas se refermer, même avec ligase. Donc dans ce cas précis il ne devrait pas y avoir de colonies sur ton contrôle.  [...] Tu as donc fait une simple digestion de ton vecteur (une seule enzyme de restriction) =. il peut donc se recirculariser tout seul ou avec ligase (voilà qui répond au post de Wobinet).  [...]

[Biologie Moléculaire] clonage directionnel

soit un clonage directionnel d'un insert dans un plasmide vecteur, c'est quand l'adn contenant l'insert et l'adn vecteur sont tout les deux digérés par les mêmes enzymes de restriction, et donc le clonage se fait par appariement d'extrémités cohésives, c'est ça.  [...] Le clonage directionnel est un clonage dans lequel le fragment cloné ne peut se cloner que dans un sens (en effet grace a des enzymes de restrictions qui forment des extremités incompatibles). Le clonage non orienté est un clonage dans lequel le fragment peut s'insérer dans les deux sens.  [...]

Gène Syncytine

Je peux cloner ce gène, l'introduire dans un vecteur ( enzymes de restriction, lygase...) + mutagenèse, j'en fait un autre témoin sans mutation, je regarde les protéines produites.  [...] en fonction des résultats, on peut choisir de passer chez l'animal, soit en faisant des modele transgéniques, soit en utilisant des vecteurs viraux, l'electroporation, etc.  [...]

[Biologie Moléculaire] Vecteur d'expression

Je n'ai pas vraiment compris comment on fabriquait un vecteur d'expression. Je m'embrouille avec ces histoires d'enzymes de restriction et de gènes codant pour la résistance à l'ampicilline, etc.  [...] les enzymes de restrictions sont utiliser, comme des ciseaux pour couper cette molecule et y coller le gène que tu veux exprimer.  [...]