• Forum - Enzymes, Plasmide, ADN

[Divers] Contenu "Matériels et méthodes" - rapport stage M1

Le gene xyz a ete amplifie a partir de l'ADN de la souche abc en utilisant les amorces A (3'sequence5') et B (3'sequence5'). Le produit PCR a ensuite ete purifie par le kit XXX (XXX, France) puis digere par les enzymes bamHI/EcoRI avant d'etre clone dans le plasmide xxx prealablement linearise par les memes enzymes.  [...] J'ai mis mes oligos dans un tableau avec les séquences et commentaires pour dire quel oligo apporte quoi dans l'histoire et j'ai fait un schéma où je les positionne sur les gènes. Le truc est que j'avais séparé mon M&M en 3. Souches bactériennes, plasmides, milieux de culture, Manipulation de l'ADN (tout ce qui est PCR), Construction des plasmides recombinants et je pensais ajouter une 4e partie Séquençage, mais là quand j'y pense, ça me paraît plus logique de le mettre dans Manipulation de l'ADN.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment choisir les enzymes de restrictions pour un clonage?

Je suis étudiante en L3 de bio. J'ai un exercice de biologie moléculaire à faire et je bloque sur le choix des enzymes de restriction.  [...] J'ai joins le fichier de mon exercice. Comment choisir les bonnes enzymes Doivent-elles être présentes sur le MCS du plasmide et absentes de l'adn du STAT5B.  [...]

[Génétique] Intégration ADNc

je ne comprends pas pourquoi le fait d'utiliser deux enzymes de restriction lorsque l'on veut insérer un ADNc dans un plasmide permet de contrôler le sens d'intégration de cet ADNc.  [...] Maintenant si tu coupes les deux bouts avec la même enzyme, tu auras des deux côtés les mêmes sites donc ton brin pourra s'insérer dans n'importe quel sens. En coupant avec deux enzymes, on a un site spécifique pour chacun des bouts, on peut donc décider dans quel sens sera intégré le morceau d'ADN dans le plasmide.  [...]

[Génétique] Tale nuclease

Bonjour, je voudrais savoir svp si quelqu'un aurais déjà entendu parler des TALENS ces des enzymes artificielles qui provoquent des cassures double brin de l'ADN je souhaite savoir si en les transfectant grce à un plasmide dans une cellules eucaryotes il faut que ce gène s'intègre a l'ADN de la cellules eucaryotes ou une simple expression transitoire suffit, Merci bcp d'avance.  [...]

clonage/enzyme en dehors du site multiple de clonage

Bonjour à tous, je vous sollicite pour une petite question. Lors d'un TP, j'ai inséré un fragment d'ADN dans un plasmide et derrière, pour vérifier la ligation, j'ai digéré le plasmide avec les 2 enzymes de restriction utilisé à la base et après migration sur gel il se trouve que au lieu d'avoir 2 fragments attendus (un fragment correspondant à mon plasmide et un fragment correspondant à mon insert) je n'ai qu'une seule bande.  [...] Il se peut que ton MCS ait été enlevé au cours du clonage (c'est normalement peu probable si tu as bien designé ton clonage). Il se peut également que le plasmide de départ soit muté et ne possède pas certains sites de restriction (également assez peu probable).  [...]

[Biochimie] Preparation et analyse de plasmides

* Dans l'analyse par électrophorèse, tu vois des choses différentes en fonction de la conformation de ton ADN. Ainsi, dans le cas simple où on utilise de l'ADN linéaire (ton plasmide en morceaux après la digestion par les enzymes de restriction), plus c'est bas, plus c'est petit.  [...] En fait, on a fait notre electrophorese sur plusieurs especes de E.coli, HRPN PGAG PCK3 et PLTR avec ECOR1 et HINDIII, une autre chose que je n'ai pas comprise, c'est. Est ce que c'est enzymes de restriction vont séparer les plasmides avec le même nombre de fragments A priori non.  [...]

[Biochimie] Manipulation de l'ADN: plasmide

L'intérêt est de couper ET notre morceau d'ADN d'intérêt ET le plasmide avec le MÊME enzyme de restriction. Ainsi lorsqu'on les mets en présence l'un de l'autre, ils auront tendance à s'attacher et nous permettre de refermer le plasmide nouvellement constitué.  [...] Le plasmide étant constitué d'ADN tu as besoin d'une origine de réplication afin de permettre aux polymérases de le reproduire dans la bactérie. Si le morceau d'ADN ajouté code pour une protéine, la présence d'un promoteur et d'un terminateur te permettra d'activer la production de la protéine à partir du plasmide.  [...]

[Biotechnologie] Interférence à l'ARN

- les shRNA, pour small hairpin. Ces ARN interférants sont aménés dans la cellule par transfection (plasmide) ou infection (lentivirus, AAV, adénovirus). Il y a ainsi production par la cellule de shRNA, dirigé contre l'ARNm de la protéine d'interêt. Pour détailler un peu plus les shRNA, ils sont transcrit comme n'importe quelle protéine, mais ils possèdent la particularité d'avoir une séquence complémentaire en mirroir.  [...] Le plasmide doit être linéarisé pour que les enzymes recombinases soient actives. Grâce à la RH, ton gène X sera introduit à la place du Y. Cependant, la RH n'est pas optimale selon le modèle biologique car un autre mécanisme de réparation de l'ADN est présent, le Non Homologous End Joining (NHEJ) qui empêche la RH car le transgène s'insère de façon non-spécifique.  [...]

[L1 BIO] TP Biologie moléculaire

Puis après on décide de faire une carte de restriction,en faisant une digestion enzymatique par l'enzyme de restriction xho1,cette enzyme se trouve de base dans le plasmide recombinant et aussi dans la séquence de l'ADN de la GFP mais pas dans celui de la Dsred.  [...] Non. Il n'y a aucune enzyme dans un plasmide (elle se cacherait où, entre les deux brins d'ADN ), il n'y en a pas non plus dans le tube contenant le plasmide, sinon il serait déjà digéré. Il n'y a pas non plus la séquence codant pour l'enzyme.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage Gateway...intérêt ?

- un premier intérêt est celui que tu dis. tu n'utilises pas d'enzymes, pas besoin de choisir 2 enzymes différentes, de déphosphoryler le plasmide, phosphoryler les primers...ect... une simple PCR suffit pour l'obtention de ton gène avec les séquences nécessaires à l'introduction dans le plasmide.  [...] ça revient au même qu'avec les enzymes pour l'insertion dans ton second vecteur sauf que là encore, tu n'a pas besoin de rédigérer ton fragment à partir de ton premier plasmide pour le mettre dans un plasmide d'expression. Ici, avec le système gateway, ton plasmide d'entré va directement servir à la recombinaison avec ton second plasmide.  [...]