• Forum - Enzyme, Vecteur, Coupe

[Biologie Moléculaire] Site de restriction

J'ai une chose que je comprend pas on choisit une enzyme qui ne coupe pas notre vecteur et qui doit être présente dans le polylinker de notre vecteur.  [...] j'ai trouvé deux enzymes (BamHI et SalI) qui sont présents dans le polylinker de mes deux vecteurs d'expression et qui ne coupent pas mon gènes comment je peux introduire ces deux site dans mes amorces pourque je puisse transférer après mon gène c'est à dire BamHI position 5' ou 3' de mes amorces et comment vérifier que mes amorces sont en phase.  [...]

[Biologie Moléculaire] PB ADN dans le puit d'agarose

Je commence mon 1 er clonage, donc pour faire court j'ai coupé mon vecteur avec une enzyme de restriction ApaI, qui devrait le linéariser.  [...] Alors quoi faire, je ne pense pas que ce soit la quantité d'ADN car j'ai refais le même protocole avec un autre vecteur et cela fonctionne.  [...]

[Biochimie] Question théorique sur clonage TOPO

L'énergie libérée lors de cette réaction permet la formation d'une liaison covalente entre l'extrémité 3' du brin coupé et le résidu tyrosyl-274 de l'enzyme. Cette liaison est ensuite attaquée par l'extrémité 5' hydroxyl du brin d'ADN à insérer dans le vecteur, ce qui a pour résultats de libérer la topoisomérase I et de lier l'insert au vecteur (Figure12).  [...] Je ne comprends pas comment on peut avoir une extrémité 5'hydroxyl j'ai lu sur internet que le produit PCR ne possédait pas d'extrémité 5'phosphate, est-ce pour cela Et si c'est le cas comment cela est-il arrivé je suis sûre qu'il s'agit d'une extrémité 5'hydroxyl car cela est écrit dans le manuel d'utilisation du plasmide (PCR4 blunt topo vector).   [...]

Confirmation de l'insertion d'un gène dans un plasmide

Je travaille actuellement sur un clone et je veux savoir s'il est possible de confirmer une ligation entre un gène et un vecteur plasmidique et par quelle méthode puis¬je la faire.  [...] Oui c'est toujours comme cela que l'on fait d'ailleurs. On établit la carte de restriction du plasmide en utilisant des enzymes de restriction. A minima, une enzyme de restriction qui ne coupe qu'une fois permettra de linéariser le vecteur et d'en trouver la taille en faisant migrer le produit de digestion dans un gel d'agarose.  [...]

[Biologie Moléculaire] précipitation de l'ADN diminution de la taille de mon fragment!!!

je digère un vecteur d'environ 6000pb avec une enzyme de restriction qui coupe une seule fois dans ce vecteur. je vérifie ma digestion sur gel d'agarose...une belle bande à 6000pb. je décide de précipiter (avec de l'éthanol) l'ADN sur la nuit. le lendemain, je re-dépose sur gel.  [...] tu as un vecteur de 6kb que tu as ouvert. A ce moment, ton gel te confirme sa taille de 6 kb. Après une nuit dans de l'éthanol, ce même plasmide ne fait plus que 2kb. Tu récupères ce fragment, tu l'intègres dans un autre vecteur, puis tu fais une PCR sur ce fragment, et là 1kb.  [...]

PCR et clonage

1- soit tu mets des sites de clonages en 5' dans tes oligos qui vont te permettre d'amplifier le fragment par PCR. Ensuite tu digeres le produit de PCR avec ces enzymes et tu le ligue dans ton vecteur coupé par les enzymes compatibles.  [...] 2- tu ouvres ton plasmide, soit avec une enzyme qui coupe franc, ou alors cohésive (et tu rempli le site avec la Klenow). puis tu clones directement le produit de PCR (qui est bout franc si tu as utilisé une enzyme fidele).  [...]

microbiologie - CARTE DE RESTRICTION

Le résultat de la digestion avec l'enzyme 2 t'indique qu'elle coupe le plasmide 1 fois mais tu ne peux pas placer son site par rapport aux sites E1.  [...] Une carte de restriction c'est une séquence où tu peux visualiser tout les sites de coupures des enzymes de restriction. Ça peut être une carte d'un plasmide où d'un génome. C'est utile pour savoir la taille de tes fragments obtenue après digestion avec une enzyme de restriction spécifique.  [...]

[Biologie Moléculaire] electophorese des fragements d'ADN

apres electophorese des 2 genes A et B on obtient le profil 1 alors je vois que dans le profil 1 on a migration de 2 fragement de gene B ça veut dire on a déja subit l'ADN a une enzyme de restriction qui a coupé B mais pas A (alors que ça n'est pas indiqué dans l'exercice).  [...] dans le profil 1 on a migration de 2 fragement de gene B ça veut dire on a déja subit l'ADN a une enzyme de restriction qui a coupé B mais pas A (alors que ça n'est pas indiqué dans l'exercice).  [...]

[Biochimie] Enzyme de restriction

Tout dépend de ton enzyme de restriction. Il en existe de toutes sortes, celles qui reconnaissent une séquence et qui coupe 100 nucléotides plus loin, celles qui vont couper à l'intérieur de la séquence de reconnaissance, celles qui vont avoir besoin de 2 séquences de reconnaissances mais n'en couper qu'une, ou même encore ailleurs, etc.  [...] Le cas le plus utilisé en biotech, c'est les enzyme de type II qui vont couper à l'intérieur de la séquence de reconnaissance. C'est en général une séquence d'environ 6 nucléotides et une séquence palindrome, c'est-à-dire que les deux brins, lus dans le même sens (3'-. 5' par exemple) vont donner la même séquence.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole pour une ligature + tranformation ?

Voilà, donc pour les infos. mon insert fait environ 700 pb, et je vais utiliser comme vecteur le plasmide pBluescript SK, et je sais quelles enzymes je vais utiliser. Si vous avez une idée de protocole, des quantités, des temps d'incubation et tout je suis preneuse.  [...] Ah oui, et j'ai dû déphosphoryler mon vecteur aussi. Je sais que c'est pas vraiment la peine quand on digère avec 2 enzymes différentes, mais ma maître de stage semblait y tenir, au cas où une des 2 enzymes n'aurait pas bien coupé (cela ne peut pas se voir sur un gel).  [...]