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[Biologie Moléculaire] Problème lors de la transformation avec DH5a E.coli.

Si tu as une enzyme avec une activite proofreading, pas de A de rajoute et donc pas de clonage. De plus generalement pour ce genre de clonage il ne faut pas purifier le produit PCR (ou alors rajouter les A apres la purif).  [...] J'ai bien vérifié, l'enzyme que j'utilise n'a pas d'activité proofreading, elle n'élimine pas le A nécessaire à la complémentarité au vecteur. Je pense finalement que le kit que j'utilise pour la ligation est pourri donc j'ai réessayer avec une autre enzyme (+ son tampon) que celui du kit.  [...]

[Biochimie] Activité spécifique enzymatique

Donc l'activité de l'enzyme est de 0,48 UIE pour 1ml (et 1,44 UIE pour 3ml je suis pas sûre).  [...] Comment fait-on pour calculer l'activité spécifique sachant que le flacon d'enzyme n'est pas pur, il contient 9,92mg de protéines totales en poudre dissoute dans 5ml de tampon et diluées au 1/281°.  [...]

[enzymologie] Activité enzymatique et flux

Tu peux essayer de réaliser une colonne enzymatique en incluant ton enzyme dans un résine et tester différents tampons, et entre chaque tampon il va falloir que tu laves avec un tampon de référence pour mesurer une activité de référence car certains tampons testés pourraient dénaturer ton enzyme.  [...] Pour cela on va chauffer l'enzyme en la mélangeant à une résine qui se liquéfie à une température de 40-42°, on applique le mélange dans une burette chaude et on fait goutter la burette dans le tampon initial de l'enzyme (Tris par exemple) à tempréature ambiante ou même plus froid.  [...]

Carte de restriction d'un plasmide inconnu

Sachant que l'on doit choisir 5 à 6 enzymes. Deja dans un premier temps comment peut on savoir lesquels choisir préférentiellement Est ce que le choix des enzymes auraient juste avoir avec les couples d'enzymes qui ont une bonne activité ensemble pour pouvoir les coupler lors des digestion avec un même tampon Je compte faire mes digestions et analyser sur gel d'électrophorèse d'agarose à 1% (ne connaissant pas du tout la taille du plasmide je suppose qu'il a plus de chance de se trouver entre 10kb et 0.  [...] Le deuxième problème est la concentration en glycerol. Généralement, les enzymes sont suspendu dans un tampon coupé à 50% de glycerol, afin d'éviter les cycles de congélation/décongélation, qui abimeraient l'enzyme. Cependant, le glycerol est très mauvais pour l'activité de l'enzyme, et communément, ont admet que la quantité d'enzyme (+glycérol) ne dois pas dépasser 10% du volume total de digestion.  [...]

[Biologie Moléculaire] Utilisation de Klenow

il faut inactiver l'enzyme préalablement, sinon elle va continuer a couper. Pas besoin de purifier le plasmide, tu peux le faire ensuite. Il faut quand même que la klenow puisse fonctionner dans le tampon utilisé pour la digestion.  [...] Par habitude, desactive toujours ton enzyme avant de faire autre chose car en changeant de tampon tu peux modifier la spécificité de son activité.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole pour une ligature + tranformation ?

Tous les buffers sont concentrés 10X. Il ne faut jamais mettre plus de 1/10 du volume final en enzyme. En général je digère dans 50µl avec 5µl de buffer et 5µl d'enzyme. Vérifie bien qu'il ne faille pas ajouter de BSA. Certaines enzymes le nécessitent. Vérifie aussi la température d'activité maximal.  [...] Certaines enzymes necessitent l'ajout de BSA dans le tampon, mais la BSA ne gène l'activité d'aucune enzyme de restrction. Donc si tu as une enzyme necessitant BSA et pas l'autre, pas de souci.  [...]

[Génétique] Transcription inverse

- Le tampon contient tout les éléments nécessaire à la stabilité et à l'activité de la Reverse Transcriptase, et en cherchant un peu notamment dans ton cours tu devrais retrouver de quelle genre de molécules il peut s'agir.  [...] Le tampon RT, comme son nom l'indique, est là pour tamponer la solution au pH adapté à l'enzyme. Il contient aussi des sels, nécessaires à son activité.  [...]

plamide repris en EDTA et digetion enzymatique

Comme l'EDTA est un chélateur de cations divalents, possible qu'il titre le Mg2+, Ca2+ etc de votre tampon et entraîne l'activité STAR.  [...] J'ai fait un test. j'ai refait une digestion avec le plasmide repris en EDTA mais je n'ai pas mis d'enzyme. Résultat. mon ADN est dégradé par le tampon, je l'ai fait avec les kits de deux fournisseurs. Il ne s'agit donc pas d'activité STAR, car il n'y pas d'enzyme.  [...]

[Biologie Cellulaire] questions annales

Ma réponse. je ne sais pas du tout comment le présenter, je sais simplement qu'il faut une complémentarité symétrique pour que lors du repliement les bases soit l'une en face de l'autre, mais quels acides aminés choisir il y en a-t-il qui soit plus a même de former ce genre de structure plutôt que d'autres faut-il inventer une succession d'acides aminés sachant pertinemment qu'il ne sont pas présents dans ce 5'UTR en particulier.   [...] dNTP tu peux appeler ça des desoxynucléotides triphosphate. Sinon un petit détail. il faut que tous ce petit monde soit dans un tampon qui soit compatible avec l'activité de la polymérase, et contenant du MgCl2 (indispensable pour le fonctionnement de l'enzyme).  [...]

proteinesdans le culot ou le surnageant

je prend un morceau de foie de poids = 35 mg, je le broie avec un tampon tris contenant le substrat de l'enzyme que je veux doser son activité. Le dosage d'activité se fait par une méthode colorimétrique.  [...] Si votre tampon initial ne contient que du tris, en principe certaines des protéines seront solubles, d'autres pas et se retrouveront donc dans le culot. Une protéine soluble n'a malheureusement aucune raison de précipiter si elle est en solution, même a haute vitesse.  [...]