• Forum - Enzyme, Produit, Fragments

Enzyme de restriction et activité étoile!

L'activité étoile survient lorsqu'une digestion ne se produit pas dans les conditions optimales de l'enzyme. L'enzyme se met à couper a peu près partout et son site de restriction, souvent, se raccourci et l'enzyme produit plus de fragments que supposé. Ma question est, disons qu'une enzyme produit des extrémités 5' cohésives théoriquement, est-ce qu'elle va continuer de produire des extrémités 5' cohésives même si elle est dans des conditions d'activité étoile.  [...] Sinon, pour s'assurer que tout les morceaux soit à bout franc, il suffit de rajouter une autre enzyme, comme la nucléase S1, par exemple (il y en a d'autre). Cela permet toujours de réaliser un clonage après purification et sélection du fragment désiré.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de clonage dans le pGEM-T easy vector.

J'ai relu le protocole pGEM-T easy et dans le troubleshooting, c'est écrit que si la réaction de ligation avec le produit PCR ne donne que des colonies blanches (pas de bleues) c'est parce que l'ampicilline sur les plaques était inactif. Je suis en train de me demander si l'ampicilline que j'ai utilisé était encore bon.  [...] Tu es sur que ton kit de PCR rajoute les A a la fin de ton produit car les enzymes fideles creent des fragments blunt end. (je ne connais pas ce kit).  [...]

[Biochimie] Mapping et Bal 31

Extracellular nucleases of pseudomonas BAL 31. III. Use of the double-strand deoxyriboexonuclease activity as the basis of a convenient method for the mapping of fragments of DNA produced by cleavage with restriction enzymes.  [...] This degradation is accomplished without the introduction of detectable scissions away from the ends of the duplexes. When this nuclease is used to produce a series of progressively shortened samples from a linear duplex DNA, subsequent digestion of these samples with a site-specific restriction endonuclease and analysis of the resulting fragments by gel electrophoresis permits the rapid establishment of the order of the restriction enzyme fragments through the entire genome.  [...]

Réplication de l'ADN

Au lieu d'être répliqué en une fois, des petits fragments (appelés fragments d'Okazaki) seront produits mais dans le sens 5'-3' (malgré que ce soit l'orientation de ton brin). Ces fragments seront ensuite rassemblés pour former un seul brin par une ligase (enzyme qui va lier tous les fragments).  [...] pour une réplication,l'ADN doit s'ouvrir çàd les brins dADN ne sont plus associés par l'intermédiaire de l'Hélicase qui va coupé les liaisons d'hydrogènes entre les deux brins, on sait que la lecture de lADN se fait de 5'vers 3' et puisque lADN est une double hélice donc il ya une partie 5'-3' et l'autre 3'-5', donc pour le 2eme cas, l'adn est synthétisé d'une façon normale et continue ( de 5'vers 3' ) mais donc le 1er cas qui est de 5 vers 3' (la synthèse serait de 3 vers 5' ce qui n'est pas habituel ) donc on a une proteine nommé ADN primase qui va synthétisé des fragements d'ARN oui je dis bien des fragments d'arn qui vont etres remplacés par la suite par des petits fragments d'adn par l'intermédiaire dADNpolymérase tu vas surement te posé la question.  [...]

[Génétique] Thérapie génique: synthétiser le gène correcteur

Et le nombre et la taille des fragments d'ADN obtenus avec une enzymes de restriction dépendent du nombre de fois où la séquence reconnue par l'enzyme est répétée au sein de la molécule d'ADN. Et donc le choix d'une enzyme de restriction dépend de la taille des fragments que l'on désire.  [...] En bref l'enzyme de restriction va permettre le clivage de l'ADN par rapport au site de restriction. Ensuite les fragments d'ADN sont séparés (ou différenciés) par électrophorèse.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de construction d'une banque d'ADNc

La vérification du clivage des ADNc par une enzyme de restriction peut se faire si le clivage génère des fragments de taille différente et suffisamment longs. Ainsi par migration sur gel d'agarose, la présence des bandes d'intérêt permet de valider le clivage.  [...] Pour l'étape de ligation, quelle quantité de vecteur utilises-tu Quels rapports vecteur.insert Quelle quantité de ligase (Unité et volume) Quel volume final représente le milieu réactionnel de ligation Combien de temps incubes-tu A quelle température Quel volume de produit de ligation utilises-tu pour transformer tes bactéries.  [...]

[Biologie Moléculaire] La carte de restriction

Si ton ADN est linéaire et que la digestion par une enzyme (exemple Bam HI) génère deux fragments (de 14 et 1 kpb), ça veut dire qu'il n'y a qu'un seul site pour cette enzyme =) comme un fil qu'on coupe en deux une seule fois. on se retrouve avec deux morceaux.  [...] La coupure EcoRI permet d'obtenir deux fragments, donc il y a un seul site EcoRI. C'est concordant avec coupure par deux enzymes qui génère 3 fragments (un site de restriction pour chaque enzyme).  [...]

[Biochimie] génétique - endonucléases de restriction

Un ADN génomique contenant 40% de guanine est hydrolysé par une enzyme de restriction reconnaissant le palindrome AATT. Quelle est la taille moyenne des fragments générés par l'hydrolyse enzymatique.  [...] Donc la probabilité de trouver un site est (1/4) n avec n la taille du site de restriction. Ce genre de calcul vous amène à conclure qu'une enzyme telle que EcoRI génère des fragments de 4096 pb en moyenne.  [...]

[Biologie Moléculaire] comment faire une mutation par PCR? - Page 2

J'ai deja commande les amorces mais les miennes ont 21nt de part et d'autre de la mutation que je veux introduire, penses-tu que je peux les utiliser quand meme ou dois-je en commender d'autres.   [...] Pour la Platinium Taq Polymerase, je connais pas cette enzyme. Mais j'aurais tendance à penser que n'importe quelle enzyme proofreading (et qui ajoute pas de A) capable de faire des longs fragments peut convenir.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

J'ai testé les différentes propositions que vous m'avez faites. J'ai pu obtenir des colonies ce matin. Seulement, il y a un souci, j'ai des colonies dans ma transformation témoin (bactéries transformées avec le vecteur ligaturé sur lui même). Je vais prendre le pari ce matin et essayer de faire des PCR de colonies pour voir si les fragments d'intérêt on bien été cloné.  [...] Suggestion. si ton clonage est à bout cohésive, coupe ton insert de 4kb en deux de 2kb (un peu près, hein.) avec une enzyme produisant des bouts cohésifs. Des fois, un clonage trois fragments fonctionne mieux q'un deux fragments (oui, je suis d'accord, c'est bizarre, mais déjà testé ).  [...]