• Forum - Enzyme, Compatible, Buffer

[Biologie Moléculaire] Buffer et enzyme differents....

Voila je voulais tout simplement savoir si y avait vraiment une importance d'utiliser le buffer et l'enzyme de la meme compagnie C'est a peu pres la meme enzyme donc le buffer devrait presque etre identique.  [...] Les buffers peuvent varier d'une enzyme à l'autre en fonction des modes de production d'une compagnie ou d'une autre. Cependant, ceci est particulièrement net pour les enzymes de restriction. Pour les autres enzymes c'est moins évident.  [...]

[Microbiologie] digestion de plasmide

H buffer est le buffer pour l'enzyme promega. Pour la même enzyme chez NEB ce sera n'importe quel tampon (NEB1 à 4). Chez fermentas, c'est le orange buffer. Chez Roche se sera le buffer A... Il va sans dire que tous ces buffers sont différents. La bonne pratique recommande d'utiliser le buffer correspondant à l'enzyme du fournisseur.  [...] Pas faux piwi. Maintenant comme tu l'as dit, le buffer est spécifique de firme alors je sais pas si c'est une meilleure idée de le faire soi-même. En pratique, l'enzyme est normalement la même, donc le tampon devrait l'être aussi. Je crois qu'il est possible de trouver un tableau de comparaison entre les buffers des différentes firmes (sur biolabs je crois).  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole pour une ligature + tranformation ?

Première question à se poser. Tes enzymes sont elles compatibles entre elles Si tu les as du même fournisseur (le plus simple quand même) tu peux aller voir leur charte d'enzyme de restriction en générale disponible sur internet. Choisi bien ton buffer.  [...] J'ai trouvé des enzymes compatibles (celles que j'avaient choisies avant ne l'étaient pas au niveau de la BSA, merci pour ce détail.).  [...]

clonage/enzyme en dehors du site multiple de clonage

Mon encadrant m'a donc dit de refaire une digestion contrôle en prenant une enzyme en dehors du site de clonage multiple (MCS) mais je ne vois pas à quoi cela va servrir.  [...] Ou peut-être ta digestion n'a tout simplement pas fonctionné (problème de compatibilité enzymes/buffer, trop petit volume + évaporation, stock d'enzyme foutu si resté à température ambiante, etc).  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction d'ADN génomique

Et pour l'utilisation du SAU3A, c'est parceque je veux faire une digestion partielle pour faire une banque et parcequ'elle est compatible avec BamH1. Et pur le tampon c'est le tampon B2 qui est normalement spécifique du SAU3A.  [...] C'est assez étrange. J'aurais plutôt tendance à penser à un mauvais ratio ADN/buffer/enzyme/volume final. Il ne change pas entre les petits volumes et les grands.  [...]

Protein en conditions réductrices

J'ai une enzyme que je souhaite protéger de l'oxydation. Je cherche un buffer pour solubiliser mon enzyme en conditions réductrices, et qui aurait la propriété de ne pas réduire les ponts disulfure. J'ai pensé au DTT, au ²-ME mais aussi au TCEP et au Glutathion.  [...] Je réponds un peu tard mais on ne sait jamais. Le DTT et le betamercapto vont permettre de réduire les ponts disulfures mais la réduction n'est pas irréversible. Pour protéger de l'oxydation on peut utiliser un composé comme l'iodoacétamide ou chloroacétamide.   [...]

[Biologie Cellulaire] Comment dissoudre la Collagenase

enzyme stock solution is prepared by dissolving 0.05 - 0.1 mg/ml collagenase in 50 mM TES buffer, pH 7.4, containing 0.36 mM calcium chloride.  [...] To make 5% stock solution, dissolve 1 g of collagenase type I (Sigma, cat. no. C-2674) in 20 mL phosphate-buffered saline (PBS). Store at 20°C in single use aliquots of approx 0.5 mL. Make up 0.25% collagenase working solution by diluting stock solution 1.  [...]

Problème de digestion enzymatique

Envoyez votre protocole en entier, détaillé, carte de restriction du fameux plasmide comprise, si vous le désirez, je verrai si je vois un truc qui saute aux yeux.   [...] et une autre bande très fiiine de 5kb et comme d'habitude j'ai fait plusieurs essais en augmentant chaque fois la quantité d'enzyme mais rien n'a changé.  [...]

[Microbiologie] digestion de plasmide

A priori l'enzyme n'est plus protégée dans son buffer de conservation et la congélation pourra sans doute un peu l'abîmer. Cependant, vous avez raison, il restera une activité résiduelle très vraisemblablement non négligeable.  [...] A présent, en général, on inactive l'enzyme en chauffant à 65-75C (variable selon les enzymes. reste qu'il ne faut pas trop chauffer sinon on dénature l'ADN). Là c'est définitif.  [...]

[Biologie Moléculaire] Restriction avec 3 enzymes ?

C'est encore moi, je dois purifier une bande sur gel mais même en faisant migrer longtemps sur du 1% agarose ma bande est trop proche d'une bande parasite (2500bp et 3000bp). Je vais essayer en changeant le % d'agarose (d'ailleurs que me conseilleriez vous comme %) et quelqu'un a t il déjà fait une triple disgestion avec des enzymes de restriction.  [...] Je pose cette quesion car je peux ajouter l'enzyme BamHI avec le même buffer qui raccourcira de 500bp la bande parasite (celle a 2500pb) et donc me laissant peut etre plus de place pour la découpe.  [...]