• Forum - Efficacité, Transformation

transformation e.coli par le plasmide pglo

Tu fais ta transfo (tu la fait bien biensur sinon ça risque pas de marcher) puis tu incube overnight. Et le lendemain tu compte le nombre de colonie positives en fonction de ta selection puis tu calcul la quantité de plasmide que tu a utilisé pour la transfo.   [...] Là tu es donc à 0.05µg/µl (puisque j'ai considéré que tes 400µg d'eau stérile c'est enfaite 400µl d'eau stérile LOL) Et donc si ta fait la transfo classique 10µl plasmide + 40µl cellules alors ta étalé 0.5µg de plasmide. Donc si t'a compté 600 colonies admettons, alors l'efficacité c'est.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

- l'efficacité de transformation obtenue avec le produit de ligation. nombre de colonies / µg d'ADN de plasmide digéré incubé avec insert et ligase.  [...] En ce qui concerne l'efficacité de ta transformation (vecteur+insert) elle n'est que de 13.10^3 bactéries transformées/µg d'ADN ce qui est faible (une valeur de 10^6 est en général souhaitable).  [...]

[Biologie Moléculaire] Efficacité de transfection

Jusque là tout va bien. Mon problème c'est V. Il s'agit dixit du volume total. mais à quoi correspond-il Au volume total de réactif de transfection + plasmide ou bien plutot au volume total de chaque cupule.   [...] Donc ma question est la suivante. quelqu'un peut-il m'expliciter la formule d'efficacité de transfection qui pourtant devrait revenir au meme qu'une formule d'Efficacité de transformation mais comme on travaille directement sur culture de cellules au lieu de travailler sur gélose comme pour la transfo bactérienn, et bien c'est bête mais on s'y perd.  [...]

[Evolution] Comment mesurer "l'efficience darwinienne" ?

On parle communément de fitness mais ce terme est appliqué à l'efficacité relative d'un individu pour la reproduction/survie par rapport à d'autres individus de la même espèce.  [...] Bon pour le taux de conversion (hum je suis plus sûre que ce soit le bon terme) je voulais dire l'efficacité de transformation des éléments récupérés dans l'environnement en tissus/individus.  [...]

a l'aide : double hubride en levure!!!!

J'ai fais queque experience preliminaire pour verifier que mes levures ont le bon phenotype, pour voir si mon gene rapporteur a une fuite transcriptionnelle, et pour voir l'efficacite de transformation et de cotransformation (sans ma banque pour l'instant). Je voudrais savoir.  [...] -quelle est la meilleure astuce pour compter les colonies sachant que pour certaines boites (surement mal etalées) les colonies ne sont pas reparties de maniere homogene.   [...]

[Biologie Cellulaire] Comportement étrange HEK293 EBNA transfectées

J'ai remarqué que cela intervenait après l'ajout de la pression de sélection. Donc la puromycine peut être en cause ou alors les cellules elles même, je me demande si elles n'ont pas subi un trop grand nombre de passages surement + de 60 des cellules non transfectées.   [...] J'ai adopté une nouvelle stratégie, vu que faire et défaire c'est toujours travailler, j'ai décongelé une ampoule de HEK 293 non transfectées d'un stock assez ancien (n'ayant pas été passé un trop grand nombre de fois) et je viens de re lancer 10 transfections différentes en parallèle, pour le moment les cellules vont bien même si je constate une efficacité de transformation de l'ordre de 20 % grand maximum avec de la Lipofectamine 2000 ou LTX d'Invitrogen.  [...]

Transformation/inativation d'un gène

Moi je voudrais déléter un gène chez Neurospora Crassa, a savoir un champignon ( je sais que les levures possèdent des plasmides, ce qui rend une transformation classique, style transformation bactérienne possible).  [...] Une dernière petite question, est que l'efficacité de transformation va être la même que j'ai les bactéries ( ou est ce que le fait d'être chez des procaryotes va diminuer un peu l'efficacité ).  [...]

Probleme d'induction de GST dans bacterie

Le protocole est assez classique. transformation de bactéries avec 5ng de plasmide par choc thermique et sélection sur pétrie avec d'ampicilline.  [...] Edit. bien sur il faut refaire une transformation, l'efficacité de la production diminuant en général avec le temps depuis la transfo. Je n'utilise jamais pour la production de transfo vieilles de plus de 3 jours.  [...]

[Biologie Moléculaire] Probleme de ligase?

1/ Calcule to efficacité de transformation, si elle est en dessous de 10^6 colonies /ug de pUC18 (ou un plasmide de petite taille équivalent), jette tes bactéries et reprépares-en d'autres (ou achètes-en d'autres). Je vois trop d'étudiants me dire j'ai transformé 1ug de plasmide et j'ai un tapis, donc mes bactos sont OK.  [...] 2/ Je n'aime pas trop que les deux partenaires d'une ligation soient extraits d'un gel, ça diminue pas mal l'efficacité de ligation. Il vaut mieux purifier uniquement le fragment sur gel et traiter le vecteur à la phosphatase (+ extraction phénol après, of course).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème lors de la transformation avec DH5a E.coli.

J'ai travaillé sur E.coli DH5a, et je me souviens que si par miracle elle poussait après ligation+transformation, après une amplification, j'avais de très faible quantité d'ADN. Donc la bactérie est peut être aussi pourrite pour ce genre de chose.  [...] 1 contrôle de transformation, avec une dizaine de picogrammes de pUC18 ou équivalent pour des bactos électrocompétentes qui sont attendues à une efficacité de 10^8 colonies par ug de plasmide.  [...]