• Forum - Efficacité, Amplification, Concentration

[Biologie Moléculaire] Gammes pour calcul de l'éfficacité de la RT-qPCR

dans le labo je fait mes calculs de quantité relative sans le calcul de l'efficacité, cet-à-dire, j'utilise E=2 (efficacité = 100%), mais si je veux faire ces calculs de la quantité relative avec la vrai éfficacité ( E differente de 2), je peux utiliser la même formule R=E^-deltaCp sauf que en se cas le E est differente de 2.  [...] L'efficacité est propre a un protocole donné, c'est à dire amorces, mix réactionnel et programme d'amplification. La seule façon de calculer l'efficacité d'une PCR est de faire une gamme de concentration en parallèle des échantillons pour chaque couple d'amorces utilisé.  [...]

[Microbiologie] cytométrie en flux

2) le Ct en PCRq c'est le nombre de cycles d'amplification nécessaires pour que la fluorescence atteigne un seuil prédéfini. Le Ct est lié a la concentration de départ de la matrice.  [...] 4) il faut mesurer l'efficacité d'amplification. Pour cela on réalise une gamme de dilutions d'un standard, et on vérifie que la concentration calculée a partir du CT est proche de la concentration théorique, ce qui signifie qu'on est proche d'une efficacité de 100%.  [...]

[Biologie Moléculaire] test d'efficacité de primers pour RT-qPCR

Pour ce faire ici les techniciens amplifient une gamme de dilution de primers sur toujours la même concentration de cDNA, et pas le contraire. J'ai toujours fait le contraire, tester l'efficacité d'amplification de mes primers à la concentration à laquelle je les utilise le long d'un gradient de cDNA.  [...] Mais pour de la quantification relative, la chose importante est de connaître l'efficacite de PCR en faisant varier la concentration de cDNA.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR en temps réel (qPCR)

Ce que dis kamor est tout a fait vrai, mais il faut au préalable s'assurer de l'efficacité de la réaction de PCR en réalisant l'amplification sur une gamme de dilutions pour vérifier la linéarité de Ct par rapport a log(concentration).  [...] si justement dans la phase exponentielle, la progression de l'amplification suit ce schéma (dans le cas ou l'efficacité est voisine de 100%).  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR en temps réel

..). Pour cela, on construit une gamme de dilutions connues, et on regarde le signal que cela donne. Ensuite, on représente le Ct en fonction de la quantité d'ADN initiale (relative ou absolue), ce qui donne une droite dont la pente est proportionnelle à l'efficacité de l'amplification ( rendement ).  [...] Sous reserve que votre quantité de matériel de départ est la même pour les deux échantillons, on peut effectivement comparer le niveau d'expression de la cible dans ces deux échantillons. Pour cela, pas besoin de la gamme, on compare le Ct de chaque échantillon à concentration identique, en prenant en compte l'efficacité de l'amplification.  [...]

[Biologie Cellulaire] enzyme de restriction

Il est très possible de cloner un fragment d'ADN génomique amplifié par PCR dans un plasmide extrait mais non amplifié, mais il est préférable de déterminer la concentration approximative disponible de ces 2 olécules avant de les utiliser.  [...] Personnellement je n'ai jamais eut de probleme, mais je passe par une etape de purification sur colone ce qui me permet probablement de m'en debarasser (de la meme maniere que les fragments d'ADN clonés apres migration sur un gel d'agarose+BET. Ceci dit, il en faut vraiment pas bcp, car meme a tres faible concentration ca inhibe tres fort la digestion.  [...]

[Biologie Moléculaire] Solution Q du kit Qiagen

Q-Solution facilitates amplification of difficult templates by modifying the melting behavior of DNA. Use of this unique reagent will often enable or improve suboptimal PCR (see figure Amplification of Difficult Templates with Q-Solution ). Unlike DMSO and other PCR additives, Q-Solution is used at a defined working concentration with any primer–template system and is not toxic.  [...] - Ensuite tu transfères ce surnageant sur la colonne de filtration. à l'aide de centrifugation et de différents lavages avec différents tampons (RPE, RW1) tu filtres ton surnageant. Les ARN restent accrocher sur la colonne.   [...]

[Biologie Moléculaire] Q-CPCR encore !

Maintenant une différence de 2x, c'est significatif si c'est reproductible, que tu as bien tenu compte de l'efficacité d'amplification de tes amorces (gamme de dilution en cascade).  [...] edit. vu la différence de quantité d'ARN, as tu fait un gel d'ARN pour vérifier l'intégrité des ARN dans l'échantillon le moins concentré Y a t il un traitement à la DNase pour t'assurer que tu n'amplifies pas le génomique qui aurait pu cntaminer l'échantillon le plus concentré D'ailleurs les amorces chevauchent elles des jonctions exon/exon, pour éviter d'amplifier l'ADN As tu un controle sans RT (donc pour lequel il n'y a pas de cDNA et qui théoriquement ne doit rien donner en qPCR ).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de Taq polymérase.

Je pense qu'il y aura qu'en même une amplification mais qui sera moins forte que si j'avais mis la bonne concentration en Taq car y aurai compétition.  [...] Je dirais tu auras peut être plus d'amplicons si tu n'as pas optimisé cet aspect de ton mix PCR, à part ça... Normalement la TAQ n'agit qu'après être fixé sur un double brin d'ADN donc la compétition je vois pas trop. Tu veux dire plusieurs Taq essayant de se fixer aux mêmes sites.   [...]

[Biologie Moléculaire] Preparation d'une gamme étalon ou standard pour PCRq

en plus il faut pour ca que. L'efficacité PCR doit être la même sur le standard ou sur les échantillons. l'efficacité (que j'appelle E dans le message précédent) ne sera pas la même dans ton standard (une seule séquence, correspondant un certain nombre de tes primers) et dans tes echantilons (plusieurs variants de séquence donc plus de fixation et d'amplification).  [...] Donc meme si tu as une séquence de ton gène en plasmide, que tu l'amplifie dans des bactéries, que tu l'extrait des bactéries, pose sur gel puis extrait du gel ta bande d'intéret, la purifie puis quantifie, tu auras la concentration que tu pourras diluer et te servir en qPCR, mais la meme quantité de transcrits, sur de l'environnemental ne donnera pas les mêmes résultats (ou alors il ne faut pas que tu utilise des primers dégénérés sur ton témoin car pour une meme quantité de primers tu n'auras pas le même taux de fixation, mais même dans ce cas, ton efficacité E ne sera pas la meme entre ton standard et ton echantillon).  [...]