• Forum - échantillon, ADN, Concentré

[biologie moléculaire] Southern blot

Etant donné que j'essayé de trouver les conditions optimal de ma sonde je travail sur un adn connu. J'ai donc choisi mon enzyme de restriction de facon a ce qu'elle ne coupe pas mon gene. En plus j'ai 3 copie du genes qui sont legerement differente... Vous comprenez pourquoi je suis autant desespéré.  [...] Pour cette échantillon je n'était qu'a 250ng/µL mais j'ai concentré mon adn par précipitation EtOH/Na Ac. J'ai concentré 2x, 3x, 4x, 5x et 6x et j'ai utilisé 25µL pour ma digestion...Donc au final j'ai une gamme qui va d'environ 5 à.  [...]

[Biologie Moléculaire] mélange équimolaire des ADNs

J'ai 10 échantillons que je dois mélanger pour obtenir un mélange équimolaire de 2µg total, ça veut dire que je dois prendre 200 ng d'ADN de chaque échantillon. Ça veut dire que si par exemple mon échantillon d'ADN est concentré à 40ng/µl, je dois prendre 5µl pour un mélange.  [...] Le volume des échantillons à mélanger est donc différent pour chaque échantillon (à cause de différentes concentrations des ADN).  [...]

[Biologie Moléculaire] Q-CPCR encore !

Si tu as utilisé la même quantité d'ARN pour les 2 RT, alors c'est que tu as bien un différence. Par contre si tu avais pris x ul de chaque échantillon pour faire la RT, alors la il faudrait normaliser par la quantité d'ARN utilisé.  [...] edit. vu la différence de quantité d'ARN, as tu fait un gel d'ARN pour vérifier l'intégrité des ARN dans l'échantillon le moins concentré Y a t il un traitement à la DNase pour t'assurer que tu n'amplifies pas le génomique qui aurait pu cntaminer l'échantillon le plus concentré D'ailleurs les amorces chevauchent elles des jonctions exon/exon, pour éviter d'amplifier l'ADN As tu un controle sans RT (donc pour lequel il n'y a pas de cDNA et qui théoriquement ne doit rien donner en qPCR ).  [...]

Utilité de la PCR en médecine ?

Faire une PCR avant de faire séquencer ton échantillon te permet d'une part de séparer précisément la région d'intérêt du reste du génome (par électrophorèse), ce que tu ne peux pas faire sans l'amplifier.  [...] Ensuite si ton échantillon n'est pas assez concentré en ADN à séquencer tu ne pourras pas le séquencer de manière fiable, d'une part parce que les séquenceurs utilisés en routine pour ce genre de manip ont un certain seuil de détection et qu'une seule molécule ne suffit pas, et d'autre part parce que tu veux que ta molécule soit séquencée plusieurs fois pour avoir une certaine profondeur de séquençage te permettant d'affirmer que la séquence que tu as est bien celle que tu avais dans ton échantillon au départ.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plan de plaque, validation de méthode...

S'il s'agit de mesurer l'efficacité de la PCR en fonction du type d'échantillon, j'imagine que vous avez prévu de faire des gammes de concentrations pour chaque. Il est bien intéressant de faire des triplicates (et non des duplicates) pour chaque point (ou par exemple pour un point concentré et un plus dilué) pour déterminer la variabilité intra-expérimentale, de même que plusieurs blancs, par exemple avant et après la manipulation des échantillons d'ADN comme vous avez l'air de le suggérer.  [...] En ce qui concerne l'efficacité de la PCR a proprement dit, je ne vois pas ou vous voulez en venir. Cette efficacité étant dépendante du milieu réactionnel, on pourrait s'attendre à une variation entre les types d'échantillon et c'est peut être cela que vous voulez estimer dans quel but Vous pourrez peut-être voir si la variabilité inter-échantillons est inférieure ou supérieure a la variation intra-expérimentale.  [...]

Probléme extraction ADN

Sinon j'attire ton attention sur le fait que si l'ADN est trop concentré au final, on inhibe totalement la PCR. C'est un peu paradoxal mais c'est comme ça. Donc pour les PCRs, il faut bien diluer des ADNs (même problème avec les cDNAs en qPCRs d'ailleurs, c'est rédibitoire.).  [...] d'abord à partir de quoi extrais tu ton ADN Est ce que tu l'extrait du mmtype de cellule Sinon apres l'extraction et avant de faire la PCR il vau mieu verifier sur gel ou par spectrophotometrie la concentration et l'integrité de ton ADN. Sinon j'ai testé different protocle d'extraction et le rendemen est en générél kifkif.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot "semi-quantitatif", pourquoi??

Il est possible en western blot d'observer des variations de quantité de protéines, mais il faut être prudent pour éviter les biais méthodologiques. par exemple quand j'en faisais, j'utilisais comme référence la quantification d'un de mes échantillons, le même tout au long de la manip, je déposais chaque échantillon en double avec 2 concentrations différentes (ce qui me permettait de vérifier la proportionnalité entre mes 2 dépôts.  [...] par exemple quand un échantillon était trop concentré cette proportionnalité n'était pas respectée. Je repassais alors l'échantillon en augmentant la dilution), chaque gel contenait des échantillons issus de mes différents groupes expérimentaux,  [...]

[Microbiologie] extraction d'ADN

J'ai pas très bien compris ton message, mais si tu doute que tu n'as pas assez d'ADN, donc tu ne vois rien sur gel, tu as 2 solutions, soit tu charge ton gel avec plus de volume (6µl ou même plus), sinon, tu peux aussi sécher ta suspension d'ADN au speedvac pour pouvoir concentrer ton echantillon.  [...] Si au contraire, tu pense que tu as un échantillon très concentré, donc tu n'arrive pas à obtenir des bandes nettes, ben tu n'as qu'à dilué ton échantillon.  [...]

[Biochimie] Problème de migration de gel

En fait on remarque surtout que la réduction empêche les traînées protéiques et les transforment en bandes bien définies, l'alkylation permet d'affiner cette résolution (mais je n'ai pas retrouvé d'image vraiment en rapport) mais elle est d'abord faite pour ne pas avoir a re-réduire les échantillons que l'on conserve pour une utilisation ultérieure.  [...] Il s' agit tout simplement de ton échantillon qui est trop concentré ou qui se trouve dans un tampon trop chargé en sel Essaie en diluant ton échantillon ou en le diafiltrant.  [...]

[Biochimie] Concentration d'un produit PCR

La comparaison de l'intensité des bandes en BEt ou en SYBRSafe donne de bons résultats, à un facteur 2 près... Il faut avoir un standard, n'importe quel plasmide linéarisé dont la concentration est connue fait l'affaire. Il est prudent de faire une gamme de dilution du standard (entre 10ng et 500 ng) pour évaluer plus finement la concentration de l'échantillon.  [...] Les autres modèles sont effectivement des spectros UV pour des échantillons de très faible volume. Leur limite de détection est donc celle d'un spectro UV classique, soit environ 1ug/ml (DO260=0.02).  [...]