• Forum - Digestion, Migration, ADN

[Génétique] Tale nuclease

Ok pour la transfection, mais en ce qui concerne la vérification par PCR, comment allez-vous procéder A partir de combien de temps allez vous récupérer l'ADN après la transfection.  [...] - extraction de l'ADN puis PCR avec des amorces specifique du gene d'interet puis digestion avec la nuclease T7 et migration sur gene d'agarose et comparaison avec le temoin ( le produit du digestion du gene d'interet sans l'action des talens).  [...]

[Biologie Moléculaire] technique d'hybridation moléculaire

.En fait y'a pas eu de conjugaison,j'ai réalisé une digestion d'ADN avec cette enzyme et une migration PFGE,ensuite j'ai hybridé mes fragments avec les sondes.  [...] Un minichromosome, par définition c'est un petit chromosome. avec les télomères, un centromère, une origine de réplication, et quelques pseudogènes (éventuellement des gènes peut-être) mais qui est plus petit que les chromosomes présents dans l'espèce, et capables de ségrégé correctement.   [...]

[Biologie Moléculaire] Le plasmide a t'il l'insert?

La dephosphorylation n'est vraiment necessaire que dans ce cas precis (ou dans le cas de tres petits inserts, pour eviter d'en inserer plusieurs, dans ce cas c'est l'insert qui est dephosphoryle). Generalement une double digestion correcte ou une selection positive est preferable.  [...] Pourquoi ne pas faire une ou plusieurs mini prép d'ADN (en priquant une ou plusieurs colonies) et simplement faire une digestion suivie d'une migration sur gel d'agarose et voir si on insert est présent. Si oui repartir des bactéries qui ont intégré le bon plasmide avec insert et faire une maxi.  [...]

[Biologie Cellulaire] enzyme de restriction

-soit on rajoute du BET dans la digestion. il va s'intercaller a la premiere coupure et empechera l'enzyme de recouper. Mais c'est vrai pour les plasmides je n'ai jamais essayé pour de l'ADNg.  [...] Personnellement je n'ai jamais eut de probleme, mais je passe par une etape de purification sur colone ce qui me permet probablement de m'en debarasser (de la meme maniere que les fragments d'ADN clonés apres migration sur un gel d'agarose+BET. Ceci dit, il en faut vraiment pas bcp, car meme a tres faible concentration ca inhibe tres fort la digestion.  [...]

[Microbiologie] Hybridation

I-CeuI can remain bound to DNA after cutting and alter migration rate of DNA during electrophoresis. To disrupt binding, add SDS to a final concentration of 0.5% or purify DNA before electrophoresis.  [...] Non, cette enzyme a tendance à rester accrocher à son site de coupure. Le SDS va dénaturer l'enzyme, qui va donc se décrocher. Il faut donc l'ajouter après la digestion et avant la migration de l'ADN.  [...]

[Biologie Moléculaire] Electrophorèse (ADN sur Agarose) et Bromure d'éthidium

en ce qui concerne l interference du BET dan la migration, comme on voulait separer de l'ADN issu de digestion plasmidique, la conformation de l ADN est aussi importante (circulaire, linéaire, superenroulée) et je pense que le fait que le BET soit présent avant la migration et s'intercalle doit modifier un peu cette conformation.  [...] -le BET introduit des supertours positifs, ce qui est tres genant pour la migration de digestions plasmidiques en ce qui concerne la forme I (surenroulée) qui est alors un peu deroulée et dont la bande sera plus rapprochée de celle correspondant à la forme III (lineaire).  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR : migration après amplification (sans digestion enzymatique)

On me demande de schématiser le résultat de la migration éléctrophorétique obtenue après amplification par PCR ainsi que la taille du produit d'amplification.  [...] Là je ne suis pas sure de moi du tout. est-ce que pour la colonie bleue il n'y a pas de produit d'amplification et pour la colo blanche il y en a un de 240 pb Je trouve ça illogique car la PCR amplifie l'ADN, or la colonie bleue même sans insert contient bien un plasmide donc de l'ADN.  [...]

Carte de restriction d'un plasmide inconnu

Ensuite, il n'est pas possible de mélanger toute les enzymes. Soyons fou, et admettons que tu veuille mettre ton plasmide et tes 6 enzymes en même temps. Tu va devoir choisir un tampon de digestion (ph, concentration en sel) unique pour toute tes enzymes. et certaines ne fonctionneront alors pas (enfin, il est possible une astuce, mais pas avec un choix restreint d'Ez).  [...] Enfin, je conseillerai de faire cette analyse en deux étapes. La première digestion/migration avec des enzymes seules (+plasmides ), les 6. Puis tu t'arrêtes, tu regardes le profil de digestion, et tu relance une digestion avec des doubles (ou triple, si possible) digestion.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de gel d'agarose

tu dis que tu purif sur colonne avant de déposer. Tu le fais systématiquement Car ca ressemble à une migration d'ADN dans un tampon un peu spécial qui modifie la migration. Quand je dis tampon spécial c'est le conditionnement de ton ADN par rapport à de l'eau.  [...] Quand tu modifies ton adn avec des enzymes les tampons d'activité contiennent souvent des produits qui pourrissent la migration, c'est surement ça.  [...]

recherche d'un contact par mail avec un laborantin

Quand au gel, un simple gel d'agarose fait l'affaire, le tampon de migration phosphate est bon aussi. je crois qu'il est également possible de marquer l'ADN à l'aide de nitrate d'argent (vieux matériel photographique). Bref, à part l'étape de PCR, tout est théoriquement faisable dans la cuisine (ultra-propre pour éviter les contaminations ).  [...] On détermine les micro-satellite de l'ADN à l'aide de technique de digestion (comme tu le dis toi même, en coupant l'ADN aux bons endroits), ou de PCR (amplification des centaines de milliers à des millions de fois d'un petit fragment, le microsatellite), puis on fait migrer l'ADN sur gel, révélation (aux UV généralement), et hop, on a nos différentes barres.  [...]