• Forum - Dégradation, Plasmide, Protéine

[Génétique] Transfection transitoire plasmide/siRNA

Ma question concerne les mécanismes qui se mettent en place après une transfection transitoire d'un plasmide codant pour une protéine ou d'un siRNA. Je m'explique. quand on transfecte un plasmide d'expression codant pour la GFP par ex c'est transitoire cad qu'au bout de 48H la fluorescence commence à disparaître (dilution globale ou par cellule) que se passe-t-il pour la descendance.  [...] - la disparition progressive de la fluorescence est-elle due à la dilution de la population ou à la dégradation du plasmide et de la protéine exprimée. quelle cinétique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transformation levure

afin de transformer des levures avec un plasmide linéarisé+cDNA pour le recombiner, on a ajouté de l' ADN dénaturé (de thymus de veau) pour favoriser la transformation. Cet ADN aurait une fonction de carrier, mais je ne comprends pas trop comment ça marche, si qlq un peut m eclairer.  [...] cet ADN protège ton plasmide de la dégradation, car il est beaucoup plus abondant que le plasmide. Donc les nucleases vont en premier le dégrader.  [...]

[Biochimie] Dégradation tag et protéase

Normalement un tag ssrA chez coli devrait marcher (enfin si j'en crois les publisque j'ai lu). Par mon experience, j'ai quand meme l'impression que la degradation est correcte mais surtout sur des proteines solubles, cytoplasmiques et non essentielles... J'avais fais des ssrA-tag sur des proteines essentielles, et ca ne degradait pas du tout.  [...] De plus, ils surexpriment Arc via un plasmide, ca ne m'etonnerais pas qu'ils sur expressent Arc au point de saturer le systeme et donc d'avoir pas mal d'Arc soluble et dans le cytoplasme. Du coup la degradation initiale est probablement juste la degradation de la proteine soluble.  [...]

ubiquitine et protéasome

Le protéasome se situe au niveau cytosolique non Si ma protéine X d'intéret s'exprime au niveau nucléaire, et si je surexprime la protéine Y permettant d'apporter X à la voie de dégradation. est ce que je peux par un marquage spé de la protéine X montré sa dégradation par exemple si le marquage de X se déplace du compartiement nucléaire vers cytosol.  [...] Si tu mets un bloqueur il n'y aura pas dégradation. Si tu vois une accumulation avec ton vecteur et sans ton vecteur (toujours avec un bloqueur) c'est que ton vecteur ne joue pas de rôle dans la dégradation. Si tu veux voir l'ubiquitination de la protéine alor sil faut bloquer le protéasome, et tu peux utiliser la technique classique de purif (mais qui est pas évidente du tout et demande un paquet d emise au point).  [...]

[Biologie Moléculaire] Purification Protéines Tag 6His

.. la protéine a pu subir une dégradation, mais pourquoi juste au moment de l'élution Peut être aussi que seule cette protéine dégradée se fixe aux billes mais pour quelles raisons.  [...] Ce qui arrive parfois avec le [His] 6 c'est qu'il se replie sur la protéine, du coup le rendement de fixation est moisi. Une petite dégradation de la protéine pourrait empêcher cela et augmenter l'affinité de cette version pour les billes. Ce phénomène est totalement protéine dépendant.  [...]

[Biologie Moléculaire] Turn over protéique

En fait je voulais savoir si les chercheurs avait essayé de mettre en évidence une protéine ubiquitine-like, une sorte de pup et donc une sorte de pupylation après avoir vu qu'il n'y avait pas d'ubiquitination... mais quand même dégradation par le protéasome.  [...] Et surtout, si c'était possible, parce qu'au moment de présenter notre article, quand sera venu le temps de la discussion, on va essayé d'emmettre des hypothèses sur le phénomène de dégradation protéasome dépendante, ubiquitine indépendante, et donc on se refèrera à l'article sur la pupylation, mais j'aurais aimé pouvoir encore compléter en expliquant une expérience pour mettre en évidence une protéine ubiquitine like intervenant dans la dégradation.  [...]

[Biochimie] Corrélation ARNm et protéine

une question me vient à l'esprit en lisant quelques articles. la surexpression d'une protéine implique-t-elle obligatoirement une augmentation de la quantité de l'ARNm ou peut-elle résulter, par exemple, d'une augmentation de l'activité ribosomale.  [...] Il ne faut pas oublier aussi la stabilité de la protéine. Un exemple. le facteur de transcription MITF est fortement exprimé transcriptionnellement dans les mélanomes, mais la forte activation de la voie des ERK, qui provoque la dégradation de la protéine MITF, entraine donc une forte dégradation de la protéine MITF.  [...]

[Biochimie] ENZYMES question

La régénération protéique est donc plutôt marginale. D'autre part, en excluant la dégradation par les protéases, la renaturation spontanée d'une protéine n'est pas triviale. De nombreuses protéines nécessitent un repliement assisté par des chaperones qui conditionnent une conformation particulière en consommant de l'énergie, pour que la protéine soit fonctionnelle.  [...] Pour la plupart des gènes exprimés, on assiste à une synthèse permanente d'ARNm suivie de la synthèse de la protéine, puis de sa dégradation plus ou moins rapide selon sa demi-vie. Ainsi il y a un remplacement permanent d'une protéine. Donc je dirais que lorsqu'une protéine est dégradée accidentellement (par la chaleur puisque tu y tiens beaucoup ), il faut attendre le temps que l'ARNm (s'il a tenu le choc) soit traduit en cette protéine, ce qui peut être très variable suivant les protéines considérées.  [...]

peptide signal et ribosomes libres

En ce qui concerne le protéasome (prix Nobel de chimie 2004), il se trouve dans le cytoplasme et les protéines sont reconnues par fixation de l'ubiquitine. l'ubiquitine sert donc de signal de reconnaissance au protéasome pour dégrader la protéine. C'est un nouveau modèle de dégradation des protéines qui, apparemment, expliquerait cette dégradation beaucoup mieux que le modèle des lysosomes qui devient alors obsolète.  [...] Il existe une maladie (je donne pas le nom sinon c'est trop simple ) qui se traduit par une surcharge lysosomale en lipides, ce qui implique des disfonctionnements dans la dégradation protéique. On ne tient pas compte de la voie de dégradation par le protéasome.  [...]

mesure de l'expression d'un gene

Pour les techniques de marquage métabolique ou de western, les questions ne sont pas du tout les mêmes. L'un permet d'estimer la quantité de protéine synthétisée (attention aux protéines instables et rapidement dégradée), l'autre c'est la quantité de protéines présente à un temps donné (néosynthèse ou pas, dégradation ou pas).  [...] Pour la proteine, le western en effet ne prend pas en compte le fait que la proteine peut se dégrader rapidement, encore une fois la question que je me pose est quel est le taux de traduction de mon ARN dans telles conditions, je pense donc que le marquage métabolique pendant un tps t est plus précis car il évite le biais de la dégradation de ma proteine.  [...]